综述：新城疫病毒病毒糖蛋白F和HN在生命周期和发病机制中的多功能性见解：一项系统性综述

《Veterinary Research》：Insights into the multifunctionality of viral glycoproteins F and HN in the lifecycle and pathogenesis of Newcastle disease virus: a systematic review

这篇系统性综述全面总结了新城疫病毒（NDV）F和HN糖蛋白的结构特征、膜融合机制及其与病毒毒力、致病表型和热稳定性的关系，重点阐述了F/HN-宿主蛋白/化合物相互作用在NDV感染、复制和致病性中的关键作用。文章强调了蛋白质相互作用组学、单颗粒冷冻电镜、全基因组CRISPR/Cas9文库筛选和计算结构生物学等技术为理解NDV及相关副粘病毒的复制和致病机制提供了新视角，并为开发针对病毒糖蛋白的高效治疗策略（如广谱抗体和抗病毒药物）提供了宝贵参考。

　　

新城疫病毒概述

新城疫（ND）由新城疫病毒（NDV）感染引起，是对全球家禽业造成重大经济损失的高度接触性传染病。NDV，曾被称为禽副粘病毒1型（APMV-1），属于副粘病毒科正禽病毒属。NDV毒株可分为两类：Class I和Class II。Class I NDV基因组长度为15,198个核苷酸（nt），主要由单个基因型（1）构成，多分离自野生鸟类；Class II NDV基因组长度为15,186或15,192 nt，由20个基因型（I-XXI）构成，通常从多种鸟类中分离。此外，NDV可根据致病性分为三种致病表型：速发型（强毒力）、中发型（中等毒力）和缓发型（弱毒力）。普遍认为Class I NDV通常无毒力，而Class II NDV在早期阶段表现出广泛的毒力和致病型多样性。

Class I和Class II NDV均包含一条不分节段的单股负链RNA基因组，该基因组由六个主要基因按3'-N-P-M-F-HN-L-5'的顺序排列，编码六种结构蛋白（N、P、M、F、HN和L）以及两种通过病毒P基因mRNA编辑产生的非结构蛋白（V和W）。这些结构蛋白构成了NDV病毒颗粒的主要组成部分，其中糖蛋白F和HN以及非糖基化的基质蛋白M紧密包围在病毒颗粒的外表面和内表面，而内部的N、P和L蛋白与病毒RNA（vRNA）主要在病毒颗粒内部形成核糖核蛋白（RNP）复合物。非结构蛋白V和W在病毒颗粒中自然存在量极少，不参与子代NDV病毒颗粒的组装。值得注意的是，F和HN糖蛋白是诱导中和性及保护性抗体以预防病毒感染的主要抗原，并且在NDV的生命周期中扮演多重角色，包括病毒吸附、融合与进入、细胞内复制、组装、出芽和释放。因此，研究这两种糖蛋白的结构和功能有助于理解NDV的感染、复制和致病机制，并有助于开发更有效的抗NDV感染的治疗策略。

NDV F和HN糖蛋白的结构特征

F糖蛋白的结构特征

不同NDV的F基因开放阅读框（ORF）长度为1662 nt，编码一个长度为553个氨基酸（aa）、分子量约为68 kDa的蛋白质。与其他副粘病毒类似，NDV F糖蛋白是一种典型的I型跨膜蛋白，主要通过诱导病毒-细胞或细胞-细胞膜融合来介导病毒进入细胞和病毒传播。NDV F糖蛋白是一种同源三聚体，经历多个加工过程。简而言之，每个NDV F单体首先作为生物学无活性的F₀前体合成，在内质网（ER）中被糖基化并形成同源三聚体。接着，F₀同源三聚体通过高尔基体运输，随后被蛋白酶水解切割激活，形成二硫键连接的F1（C端）-F2（N端）复合物。F1亚基按顺序包含几个功能域：融合肽（FP）（aa 117-142）、两个疏水七肽重复（HR）域（HRA（aa 143-205）和HRB（aa 464-491））、跨膜（TM）域（aa 501-521）和胞质尾（CT）域（aa 523-553）。除此之外，F1亚基的HRA和HRB域中大约有250个aa残基，可进一步分为三个子域（称为DI、DII和DIII）和三个连接区（称为DIII-DI、DI-DII和HRB连接子）。

NDV F糖蛋白是一种糖基化蛋白，含有六个潜在的N-连接糖基化位点（N85、N191、N366、N447、N471和N541），这些位点在大多数NDV中保守，并在F的融合活性以及NDV的毒力、复制和致病性中起着至关重要的作用。NDV F糖蛋白还包含13个半胱氨酸（C）残基（C27、C76、C199、C338、C347、C362、C370、C394、C399、C401、C424、C514和C523），它们参与F糖蛋白中二硫键的形成。

副粘病毒（包括NDV）的F糖蛋白经历一个大的、不可逆的构象变化/重折叠事件，从融合前形式转变为融合后形式，促进病毒-细胞膜融合并打开一个孔道将病毒基因组递送到细胞质中。迄今为止，大多数副粘病毒（以NDV、麻疹病毒（MeV）、人副流感病毒3型（hPIV3）和人偏肺病毒（hMPV）为代表）的融合后F构象已被解析，但其融合前构象仍然缺乏。对NDV、MeV、hPIV3和hMPV融合后F单体的全局叠加分析表明，它们的晶体结构总体上具有良好的一致性。然而，这些病毒F结构仍观察到部分差异，因为最佳全局比对中的最大差异位于DII和HRB区域，HRA和HRB连接子区域的偏差也很明显。

HN糖蛋白的结构特征

不同NDV中HN基因的ORF长度从1713到1851 nt不等，编码至少九种不同长度的变体，包括570 aa、571 aa、572 aa、577 aa、578 aa、580 aa、582 aa、585 aa和616 aa变体。HN糖蛋白的长度多样性源于NDV HN基因ORF终止密码子位置的差异，每种长度可以代表一个病毒谱系和毒力致病型。含有577 aa的HN可见于中等毒力和无毒力NDV，而含有571 aa或616 aa的HN仅存在于强毒力和无毒力NDV中。然而，只有含有616 aa的HN糖蛋白（HN₀前体）需要翻译后切割其C端45个aa才能激活。

与病毒F糖蛋白类似，NDV和其他副粘病毒的HN糖蛋白也是一种糖基化蛋白，糖基化对其正确折叠、稳定性、细胞内运输和受体结合非常重要。NDV HN糖蛋白含有六个潜在的N-连接糖基化位点（N119、N341、N433、N481、N508和N538），分布在茎部和球状头部域。除了N508位点在部分NDV中缺失外，其余五个糖基化位点在不同NDV中相对保守。

NDV、PIV5、hPIV1-4、腮腺炎病毒（MuV）和仙台病毒（SeV）的HN糖蛋白已被证明形成活性四聚体，而其NA域主要以单体形式存在。迄今为止，只有NDV和PIV5的HN糖蛋白具有完整的头部和茎部区域的四聚体结构。对其晶体结构的分析表明，球状头部域由四个六叶片β-螺旋桨状折叠的单体（NA1、NA2、NA3和NA4）组成，每个单体包含一个位于中央的位点I，该位点也具有NA活性。此外，发现位点II位于NDV HN球状头部NA域的二聚体界面，而不是PIV5 HN中，它由来自两个单体的疏水残基组成，与唾液酸相互作用但缺乏NA活性。

NDV F和HN糖蛋白的膜融合机制

病毒进入宿主细胞是副粘病毒执行其生命周期的必要步骤。副粘病毒（包括NDV、PIV5、hPIV1-4和MuV）F糖蛋白被HN糖蛋白触发的膜融合效率 critically 影响病毒进入的程度。共识是，对于大多数副粘病毒，病毒诱导的膜融合需要HN和F糖蛋白的积极参与，hMPV、尼帕病毒（NiV）和亨德拉病毒（HeV）除外。研究表明，副粘病毒HN糖蛋白需要稳定F糖蛋白以防止在细胞受体结合之前病毒失活，然后一旦宿主细胞受体被结合，病毒HN糖蛋白的茎部域与其球状头部的位点I和/或II通信以激活F三聚体。之后，三聚体F糖蛋白经历进一步的剧烈结构重排，从融合前状态转变为融合后构象状态，从而驱动病毒-细胞膜融合。因此，大多数副粘病毒的膜融合和进入是由F和HN糖蛋白介导的一系列协同步骤决定的。

与其他副粘病毒F糖蛋白类似，NDV F糖蛋白在病毒感染的细胞中也包含两种不同的构象状态，其中融合前F三聚体是一种新合成的F单体在内质网中折叠形成的亚稳态高能构象，而融合后F三聚体是当HN糖蛋白结合细胞表面受体后，经过ATP非依赖性的F构象变化后形成的高度稳定的低能构象。因此，相信从高能到低能的转换驱动了F三聚体重折叠过程中的膜融合过程。大多数副粘病毒融合后三聚体F蛋白的晶体结构已被确定，但融合前F三聚体通常不可用。然而，来自其他副粘病毒（如hPIV3、PIV5、HeV和琅琊病毒（LayV））的融合前F结构的比较表明，融合前F三聚体在副粘病毒中高度相似。

人们接受副粘病毒HN糖蛋白作为细胞受体结合的结果而发生结构构象变化，这最终导致F糖蛋白在正确的时间和地点被激活。目前，主要提出了五种模型来解释HN四聚体如何移动以主动触发F三聚体，包括滑动模型、茎部暴露/诱导契合模型、安全扣模型、双齿附着蛋白/F相互作用模型和受体诱导寡聚化模型。其中，针对NDV和PIV5的茎部暴露/诱导契合模型突出了由头部附着蛋白构建体介导的受体依赖性组成性生物活性，这可能代表了副粘病毒共享的膜融合和病毒进入机制。在该模型中，HN四聚体呈现“4个头向下”构象，其中每个二聚体头部单元的两个较低头部与HN茎部的C端区域发生物理接触，从而直接覆盖F结合/激活位点并阻止细胞内HN/F相互作用。当与细胞表面的唾液酸受体结合后，HN四聚体经历从无活性的“4个头向下”状态到激活的“4个头向上”状态的构象变化，这暴露了HN茎部内的F激活区域，以便与F糖蛋白进行物理相互作用。F糖蛋白激活被触发后，FP附近的HRA发生主要的构象变化，将FP向外延伸以插入靶细胞膜。这个过程导致形成预发夹中间体，该中间体同时将F糖蛋白锚定在病毒膜和细胞膜上。

在由HRB连接子重折叠引起的融合中间体形成之后，TM域附近的HRB转移以反平行模式结合HRA，从而形成一个稳定的六螺旋束（6HB），将两个膜拉近到足以发生膜融合的距离。

NDV F和HN糖蛋白与毒力、致病表型和热稳定性的相关性

F糖蛋白切割位点是NDV毒力的先决条件

先前的研究表明，不同的NDV致病型与F糖蛋白切割位点（Fcs）的基序相关，因为宿主蛋白酶对含有弗林蛋白酶基序的F₀前体蛋白切割成F1和F2亚基对于子代NDV在宿主细胞和组织中具有感染性并有效复制至关重要。研究发现，强毒力（速发型和中发型）NDV在Fcs处有一个多碱性aa基序（112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117），可以被普遍存在的弗林样蛋白酶在细胞内切割，这赋予NDV在多种组织中复制的能力；而弱毒力（缓发型）NDV在Fcs处有一个单碱性aa基序（112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117），只能被胰蛋白酶样蛋白酶在细胞外切割，这将病毒复制限制在呼吸道和肠道。因此，Fcs基序被认为是NDV毒力的主要决定因素，并用于区分强毒力NDV和弱毒力NDV。

自1999年建立NDV反向遗传学操作以来，Fcs基序在NDV毒力和致病型中的作用得到了广泛研究。第一个证据是，弱毒力NDV LaSota的基因标记衍生物（rND-FLtag），其原始Fcs基序（GRQGRL）被改为强毒力NDV的共识切割位点（RRQRRF），其毒力显著增加（脑内致病指数（ICPI）值从0.00增加到1.28）。随后，其他几个研究小组证明，用强毒力NDV的Fcs基序（R/K-R-Q/K-K/R-R-F）替换弱毒力NDV的Fcs基序（G/E-R-Q-G/E-R-L）显著增加了重组NDV的毒力（表现为ICPI、静脉致病指数（IVPI）值增加和/或平均死亡时间（MDT）值减少）和致病性，并改变了病毒的致病表型。相反，含有弱毒力NDV Fcs基序的重组中发型和速发型NDV表现出降低的毒力和致病性，并改变了致病表型。此外，研究人员将速发型NDV rBan/010的Fcs基序替换为弱毒力AMPV-2、AMPV-7和APMV-8的Fcs基序，产生了几种重组NDV（rBan-APMV2、rBan-APMV7和rBan-APMV8），但病毒的ICPI值明显低于亲本病毒，符合缓发型NDV的标准。因此，这些结果无疑证实了先前的假设，即Fcs基序是NDV毒力的重要决定因素。

F和HN糖蛋白共同决定NDV毒力和致病表型

如上所述，Fcs基序并不能完全决定NDV的毒力和致病型；因此，随后评估了在不同NDV之间携带HN和/或F基因交换的嵌合病毒。在速发型rBC和缓发型rLaSota之间进行HN基因交换的结果表明，携带LaSota HN基因的嵌合病毒rBC(HN)LaSota的毒力明显低于亲本病毒rBC，而 reciprocal 嵌合病毒rLaSota(HN)BC与其亲本病毒rLaSota相比具有中等毒力。此外，与接种rBC和rLaSota的鸡相比，感染rBC(HN)LaSota和rLaSota(HN)BC的鸡具有高得多的和低得多的存活率。更具体地说，与病毒rLaSota和rBC(HN)LaSota相比，病毒rBC和rLaSota(HN)BC在鸡胚多种组织中广泛传播，这证明HN糖蛋白决定了NDV的组织嗜性，并有助于病毒的毒力和致病表型。类似的发现在速发型rJS/7/05/Ch和中发型rMukteswar之间的HN基因交换、速发型rSG10或缓发型rLaSota与其他不同毒力程度NDV之间的HN基因交换、以及中发型rNDVFLtag和速发型rHerts之间的HN基因交换中也有报道。

值得注意的是，虽然F和HN糖蛋白在NDV的复制和致病性中发挥协同作用，但关于不同NDV之间单一F基因替换的报告很少，而且这些研究的结果并不总是一致的。这些结果表明，单独的F糖蛋白不足以决定NDV毒力。因此，进一步评估了F和HN糖蛋白在NDV毒力决定因素中的潜在作用。

有报道称，具有强毒力Fcs的弱毒力rLaSota（rLaSoVF）的ICPI和IVPI值显著增加，与速发型rBC的致病性指数相似；更重要的是，携带rBC HN基因的嵌合病毒rLaSoVF(HN)BC具有与rLaSoVF和rBC相同的毒力表型，但与rLaSota(HN)BC和rLaSota相比，rLaSoVF(HN)BC的致病性显著增加。此外，对几种产生的嵌合病毒的研究结果表明，两种对比鲜明的表型与F和HN胞外域的来源密切相关，它们共同决定了NDV和APMV-2的细胞融合、组织嗜性和毒力表型。其他研究人员也证明了同源F和HN糖蛋白在某些NDV中的重要性。尽管如此，这些研究仍然表明F和HN糖蛋白共同决定了NDV的组织嗜性、毒力和致病表型，这大大增加了我们对NDV毒力和致病机制的理解。

F和HN糖蛋白对NDV热稳定性的贡献

在各种ND疫苗中，具有热稳定性和无毒力特性的减毒活NDV具有可通过饮水、喷雾和食物投喂，以及运输和储存不受冷链限制的优点，被广泛用于ND控制，尤其是在发展中国家和最不发达国家。大多数NDV是热不稳定的，在50-55°C暴露30分钟会失去感染能力，但一些热稳定NDV可以在56°C下保持血凝（HA）活性和感染性超过30分钟。迄今为止，已报道了几种具有不同基因型和致病表型的热稳定NDV。然而，大多数传统使用的NDV活疫苗株，如B1、VG/GA、Clone-30和LaSota，是热不稳定的。先前的一项研究报告称，HN和M蛋白都与耐热NDV相关，但自那以后，决定NDV热稳定性的关键因素没有取得重大进展。此外，研究表明，当前的商业减毒活ND疫苗可以提供针对不同基因型NDV的理想保护，但由于疫苗株与流行株的基因型不匹配，它们不能完全阻断病毒排出和传播。因此，了解NDV热稳定性的决定因素将有助于开发更热稳定和有效的活ND疫苗候选株以应对流行强毒NDV的挑战。

目前，反向遗传学技术已被应用于阐明与NDV热稳定性相关的分子基础。热不稳定NDV LaSota和热稳定NDV TS09-C之间病毒基因交换的结果表明，携带TS09-C HN糖蛋白的嵌合病毒rLaSota(HN)TS09表现出热稳定表型，反之亦然，这表明HN糖蛋白是NDV热稳定性的关键决定因素。在另一项不同的研究中，发现热稳定NDV HR09的HN糖蛋白中的三个残基（I175、V194和E258）的突变显著降低了突变体NDV的热稳定性、HA滴度以及NA和融合活性。与这些发现一致，另一项研究报告称，HN糖蛋白中的三个残基315、329和369，特别是突变S315P和I369V，显著增加了NDV的热稳定性、HA和NA活性，从而证明HN蛋白是NDV热稳定性的主要决定因素，并且残基315和369对病毒热稳定性有重要影响。

值得注意的是，在HN C端截短39个aa的突变病毒rV4-HN-tr的热稳定性与亲本V4株相似，并且用rV4-HN-tr免疫的鸡的NDV特异性抗体滴度和免疫保护效率高于V4。此外，其他研究揭示HN和F糖蛋白或单独的P蛋白都可以促进NDV的热稳定性。造成这些差异的原因可能是这些基因交换的NDV中过度的生物学或系统发育差异导致了热稳定性决定因素的真正差异，而且，具有相似遗传背景但耐热性不同的NDV仍然太少，无法阐明NDV热稳定性的决定因素。因此，需要更多的研究来阐明病毒蛋白与NDV热稳定性之间的关联。即便如此，这些结果证明HN糖蛋白在决定NDV热稳定性方面起主要作用，其他病毒蛋白也有助于这一特性。此外，这些发现可以有效地促进开发新型嵌合活ND疫苗，该疫苗具有热稳定和基因型匹配的特性，以对抗NDV感染。

NDV F和HN糖蛋白与宿主蛋白/化合物的相互作用

参与病毒吸附过程的相互作用

HN糖蛋白有三个主要功能：（i）将NDV病毒颗粒附着到含唾液酸的细胞表面受体上；（ii）促进F糖蛋白的融合活性，使病毒进入宿主细胞；（iii）切割唾液酸以从感染细胞表面释放子代病毒颗粒并防止病毒自身凝集。其中，HN介导的病毒对宿主细胞的吸附是决定NDV感染成功的第一步。一项先前的研究表明，神经节苷脂是主要受体，N-连接糖蛋白是次要受体，它们对NDV的吸附和进入至关重要。然而，后续研究表明，神经节苷脂对于NDV的结合、融合或感染性不是必需的，而α2,3-和α2,6-连接的唾液酸是NDV有效附着和进入宿主细胞所必需的。此外，这两种唾液酸受体都可以在鸡神经系统中启动NDV感染，从而为NDV在鸡体内的神经嗜性提供了直接证据。最近，溶质载体家族35成员A1（SLC35A1）被证明是促进NDV复制的关键宿主因子，因为敲除SLC35A1会降低细胞表面α2,3-和α2,6-唾液酸的表达，并导致NDV吸附和内化过程显著减少。此外，另一项研究报道了宿主蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）与NDV HN糖蛋白的新型相互作用，这种相互作用在NDV感染周期的吸附阶段起着重要作用。

几种宿主蛋白或化合物通过靶向NDV HN糖蛋白影响病毒吸附过程。NDV感染可在许多组织中随时间持续上调鸡半乳糖凝集素1B（CG-1B），并且CG-1B在体外直接与NDV病毒颗粒结合以抑制病毒HA活性。进一步分析表明，特定的G4 N-聚糖显著增强了CG-1B与HN糖蛋白之间的相互作用，这导致病毒吸附和复制水平的降低。此外，一些化合物，包括高丽槐素（SR-1）和刺桐异黄烷酮（SR-2）、硫酸化川明参多糖（sCVPS）、1-甲酰基-β-咔啉衍生物（化合物6、7和9）以及水黄皮素，已被报道通过直接与NDV HN糖蛋白相互作用来减少病毒吸附过程，从而表现出抗病毒活性。值得注意的是，NDV HN糖蛋白内的R197、H199、R363和R523残基是sCVPS的主要结合位点，与R363的结合尤其能有效掩蔽唾液酸结合位点，这为开发针对NDV及相关副粘病毒的高效抗病毒策略提供了宝贵信息。

参与病毒融合和进入过程的相互作用

迄今为止，已有报道宿主蛋白或化合物与F或HN糖蛋白的相互作用影响NDV的融合和进入过程。一项先前的研究表明，在NDV HN糖蛋白的茎部域（残基69和77）添加N-聚糖会阻止其与F糖蛋白的相互作用并阻断病毒融合。此外，在HN结合细胞表面受体后，F糖蛋白与细胞异构酶的相互作用增加，这导致NDV F糖蛋白中二硫键减少，产生融合开始早期阶段所需的游离硫醇。此外，最近的一项研究报告称，波形蛋白与中发型NDV的HN糖蛋白的相互作用比与速发型NDV的HN糖蛋白的相互作用强得多，但它在鸡巨噬细胞中参与了速发型NDV生命周期的多个方面（包括病毒内化、融合和释放），而不是中发型NDV的 lifecycle，这揭示了HN-波形蛋白相互作用在速发型NDV感染中的关键作用。

除了受体结合和膜融合，研究人员还关注了参与NDV进入过程的不同内吞途径。三种主要的内吞途径，网格蛋白介导的内吞作用、动力蛋白和小窝介导的内吞作用以及巨胞饮作用，已被证明介导NDV进入细胞。最近的一项研究揭示，NDV F糖蛋白和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）以及磷脂