综述：利用多组学方法破译肿瘤进化并改善肺癌的诊断和治疗

《Biomarker Research》：Harnessing multi-omics approaches to decipher tumor evolution and improve diagnosis and therapy in lung cancer

本综述系统阐述了多组学（Multi-omics）技术在肺癌研究中的应用与前景。文章指出，单组学分析难以全面解析肺癌的复杂性、异质性及肿瘤微环境（TME）中的细胞互作，而整合基因组学、转录组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学等多维度数据的多组学方法，为构建详细的肿瘤生态系统图谱、发现新型生物标志物、优化精准诊疗策略提供了全新视角，有望显著提升肺癌的早期诊断、预后评估及治疗反应预测的准确性。

　　

从单组学到多组学：范畴与独特特征

肺癌是全球范围内对人类健康的重大威胁。尽管诊断和治疗策略取得了显著进展，但大多数国家的肺癌五年生存率仍低于20%。单组学方法，如全基因组测序（WGS）、单细胞测序和空间转录组学，已在肺癌的肿瘤发生、发展研究中取得进展，并部分阐明了其进化过程。然而，由于肺癌的复杂性、异质性及其与免疫微环境的相互作用，单维度方法难以区分这些混杂特征。

多组学方法提供了一个整体框架，用于构建详细的肿瘤生态系统图谱，从而促进建立更稳健的精准诊疗分类系统，并有助于发现新的癌症生物标志物。多组学整合通常采用两大策略：同一组学层内的水平整合和跨不同生物学层次的垂直整合。

水平整合的典型例子是转录组学层内不同技术的结合。例如，空间转录组学和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的结合解决了各自独立应用时的局限性——空间转录组学的混合细胞信号和分辨率限制，以及scRNA-seq空间信息的丢失。这种结合能够精确绘制亚细胞群分布图，揭示其在TME内的分子状态和空间组织。一个显著的例子是发现了KRT8⁺肺泡中间细胞（KACs），这些细胞比肺泡细胞更靠近肿瘤区域，代表了早期肺腺癌（LUAD）中肺泡II型（AT2）细胞向肿瘤细胞转化过程中的中间状态。

垂直整合则连接了从基因组学到代谢组学等多个生物学层次，从而将遗传改变与转录失调、代谢重编程以及最终的肿瘤-免疫相互作用联系起来。例如，全外显子组测序（WES）和WES在基因组水平识别驱动突变和结构变异。然后，批量RNA测序（RNA-seq）可用于验证这些基因组改变是否导致转录失调，突出显示肿瘤与正常组织之间差异表达的途径。scRNA-seq通过揭示哪些特定细胞群体驱动这些转录变化，并识别携带特定突变的亚群，进一步细化这一分析。将WES/WES衍生的突变数据投射到scRNA-seq图谱上，可以绘制携带突变的细胞类型，并评估这些突变如何在单细胞水平重塑转录状态。最后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术进行的代谢组学验证改变的代谢基因表达是否导致可测量的代谢物水平和通路活性变化。这种跨层工作流程能够构建基因组（DNA）-转录组（RNA）-细胞网络（scRNA-seq）-代谢组模型，为探索肺癌异质性、肿瘤免疫微环境和治疗脆弱性提供了一个多维框架。

多组学分析促进对肿瘤分子进化的理解

肺癌可以被概念化为一个复杂且动态的生态系统，其中癌细胞不仅与其克隆群体相互作用，还与TME内的细胞和非细胞成分以及远处器官生态位相互作用。肿瘤生态系统通过施加选择压力驱动遗传和表观遗传改变，从而在塑造肿瘤进化中发挥关键作用。同时，TME中发生炎症、免疫浸润和代谢适应，促进肿瘤进展和远处转移。多组学方法的整合为追踪肿瘤进化和在多维度识别肺癌生物标志物提供了一个更全面的框架。

多组学对癌前病变和早期肺癌的见解

在肺癌的癌前和早期阶段，细胞内的遗传和表观遗传改变，以及微环境中细胞群体的动态重塑，创造了一个有利于早期克隆扩张的进化背景。结合scRNA-seq和空间转录组学分析的研究表明，高水平的T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域-3（TIM-3）表达与抗原呈递通路活性降低和T细胞功能受损相关。这些TIM-3⁺细胞主要位于癌前病变和邻近肿瘤区域，从而将TIM-3确定为LUAD癌前干预的潜在生物标志物。此外，WES与批量RNA-seq的整合已被用于区分病理学和放射学亚型，揭示了EGFR/TP53突变的作用以及肿瘤突变负荷（TMB）在早期进展中的动态变化。联合分析空间转录组学和scRNA-seq描绘了不同细胞类型的空间分布和动态进化，揭示了血管生成和基质相关癌症相关成纤维细胞（mCAFs）在促进早期LUAD侵袭中的协同作用。为了识别可能驱动或维持肿瘤发生的上皮亚群，整合的基因组学和转录组学分析表明，AT2细胞及其增殖亚群是肺癌易感性的主要贡献者。进一步的scRNA-seq和空间转录组学分析表明，KRT8⁺肺泡中间细胞（KAC）在早期LUAD中从癌前AT2细胞向恶性细胞转变过程中充当中间亚群，其存在与较差的生存率相关。

除了基因组变化，早期的代谢重塑提供了补充性的生物标志物。一个涵盖基因组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和糖基化蛋白质组学的整合框架将异常的胆固醇代谢确定为原位腺癌（AIS，癌前阶段）恶性转化的关键事件，并将内质网应激确定为进展至浸润性腺癌（IAC）的特征。

肺癌进展的多组学剖析

肺癌进展是一个多步骤的进化过程，不仅由肿瘤细胞内的遗传和转录改变塑造，也由TME的动态重塑所塑造。整合多组学方法极大地提高了我们描绘肿瘤内在进化和TME重塑的能力，从而为识别生物标志物和治疗脆弱性提供了更全面的框架。

在肺癌的进展和转移过程中，亚克隆选择和克隆多样化经常发生在许多肺癌驱动基因中，并且在塑造肿瘤进化方面可能比祖先克隆选择施加更强的影响。肿瘤内异质性（ITH）通常表现为空间克隆多样性，其特征是分支进化轨迹和向祖先克隆的转变，这是肿瘤复发的基础。通过整合WES和RNA-seq，研究表明表观遗传失调、等位基因特异性表达和RNA编辑是ITH的主要贡献者，与DNA进化相互作用以驱动非小细胞肺癌（NSCLC）的表型选择、进展和转移。同时，肿瘤进展伴随着代谢重编程，这为诊断和治疗干预提供了重要机会。代谢组学分析检测到LUAD肿瘤转化和侵袭过程中显著的代谢变化，包括胆汁酸代谢、谷胱甘肽代谢、β-丙氨酸代谢、烟酰胺/烟酸代谢和精氨酸/脯氨酸代谢的改变。整合的转录组学、蛋白质组学和代谢组学进一步确定，糖酵解酶如醛缩酶C和烯醇酶2的过表达与LUAD中的乳酸积累和代谢适应有关。

TME是一个高度复杂的生态系统，由恶性细胞和非恶性细胞组成，它们组织成不同的结构排列，在肿瘤起始和进展中起着关键作用。多组学极大地改善了识别不同细胞亚型和相互作用的能力。通过整合WES、批量RNA-seq、scRNA-seq和空间转录组学，研究表明，从正常肺组织到非典型腺瘤样增生（AAH）和早期AIS的转变过程中，内皮细胞（ECs）和基质细胞的相对丰度减少。相比之下，末端ECs和mCAFs在晚期AIS期间增加，可能促进LUAD中的上皮-间质转化、血管生成和组织侵袭。重要的是，免疫细胞（如自然杀伤（NK）细胞和CD8⁺ T细胞）的丰度与ECs共变，突出了血管系统与免疫浸润之间的联系。此外，通过整合RNA-seq、scRNA-seq、蛋白质组学和空间转录组学，发现升高的血小板反应蛋白-2阳性癌症相关成纤维细胞（THBS2⁺ CAFs）被确定为进展的生物标志物，与早期LUAD中免疫浸润减少和免疫治疗反应差相关。TME成分的遗传改变和组成变化可以建立免疫抑制微环境。例如，RNA-seq、DNA甲基化和蛋白质组学的整合分析表明，STAT5A的高甲基化与肺鳞状细胞癌（LSCC）中的免疫细胞耗竭相关，富集于免疫“冷”肿瘤，并伴随着树突状细胞和效应器特征的减少。多组学和空间分析还表明，LUAD组织学进展是由表观遗传和转录重编程驱动的，重塑了肿瘤内在状态和TME。

肺癌转移的多组学剖析

转移始终起源于亚克隆的扩张。祖先克隆可能被化疗选择性抑制，导致源自复发起始祖先克隆的亚克隆出现。这一过程通过整合WES、WGS和转录组测序得以阐明。在转移进展过程中，推断转移潜力的重要因素是肿瘤区域内突变的进化背景，即区域不占优势的亚克隆突变比例较低，系统发育主干减少。值得注意的是，TRACERx研究的结果表明，大多数转移发生在原发肿瘤内最后一次克隆扫荡之后，祖先克隆突变主要在转移灶中持续存在。此外，在NSCLC中使用scRNA-seq、空间转录组学和WGS的研究表明，脑转移的特征是高染色体不稳定性和一个反复出现的染色体不稳定性高（CIN^high）神经样癌细胞状态，该状态在原发灶中存在并在脑中变得富集。脑转移还显示出脑适应性的、免疫抑制的TME，CD8⁺ T细胞浸润减少，Tregs增加，多样的髓系群体和促进血管生成和免疫逃避的血管周围信号。

此外，代谢重编程和血管生成通过培养有利于肿瘤细胞存活的增殖微环境，同时在驱动免疫逃避方面发挥关键作用。例如，通过对配对的原发肺肿瘤和脑转移瘤进行基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和scRNA-seq整合分析，研究表明肺癌脑转移（LC-BrM）显示出更高的肿瘤内异质性，具有LC-BrM富集的局灶性体细胞拷贝数变异（SCNAs）。并且倾向于具有氧化磷酸化（OXPHOS）高、免疫“冷”状态的患者预后较差，对线粒体抑制剂gamtinib敏感。原发肿瘤系统性地重编程血管内皮以扰乱稳态并为转移性生长准备血管生态位。亮氨酸丰富α-2-糖蛋白1（LRG1）是一种内皮细胞相关的血管生物标志物，可由内皮细胞以STAT3依赖性方式上调。通过整合RNA-seq、scRNA-seq和血清蛋白质组学，LRG1已被确定为转移进展的指标。

多组学分析在肺癌诊断中的应用

液体活检方法，如循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞游离DNA（cfDNA）、循环肿瘤细胞和外泌体检测，由于其非侵入性、可重复获取和能够实现实时监测的优势，近年来受到相当多的关注。然而，它们当前的应用仍受限于灵敏度不足和难以捕捉动态变化，导致诊断准确性受限，在肺癌诊断中的效用降低。相比之下，整合多组学策略提供了跨多个分子层次的深入分析，可以弥补液体活检的缺点，提高早期检测的准确性，并揭示肿瘤异质性和微环境重塑机制，从而在推进肺癌诊断和精准治疗方面具有更大前景。

SCLC和NSCLC的当前分子亚型分类

小细胞肺癌（SCLC）在遗传上以存在TP53突变和大多数病例中视网膜母细胞瘤1（RB1）缺失为特征。基于关键转录因子（包括achaete-scute家族bHLH转录因子1（ASCL1）和神经元分化1（NEUROD1））的不同表达，SCLC的神经内分泌（NE）亚型被分类。除了这些成熟的NE生物标志物外，还发现了新兴的非NE SCLC生物标志物，包括YES1相关蛋白和以干扰素-γ（IFNγ）激活和免疫检查点相关基因高表达为特征的炎症表型。值得注意的是，SCLC表型在整个疾病进展过程中表现出动态可塑性，突出了持续监测以捕捉肿瘤亚型、克隆进化和耐药机制不断演变的复杂性的必要性。

NSCLC包括一组异质性恶性肿瘤，根据组织病理学特征分类，包括LUAD、LSCC、大细胞癌和混合型癌。诊断技术的进步促进了精确区分由不同致癌改变驱动的NSCLC亚组的分子特征的识别。值得注意的是，EGFR和KRAS突变是NSCLC普遍的分子驱动因素。尽管取得了这些进展，一些局限性仍然存在，需要进一步改进诊断方法以提高准确性和全面性。传统的检测方法通常无法捕捉早期NSCLC的全部复杂性，特别是在肿瘤异质性和不断演变的分子景观背景下。通过整合多层数据，多组学方法解决了这些挑战，提供了对NSCLC亚型更全面和精确的表征。这种整合策略增强了早期检测，促进了个性化治疗策略，并最终改善了临床结果。

多组学方法的整合促进肺癌分类

多组学方法的整合显著推进了NSCLC的分类和诊断方法。一项蛋白质组基因组分析确定了五种不同的NSCLC多组学亚型，每种都具有独特的分子特征。例如，亚型1（代谢型）主要代表EGFR和TP53突变的LUAD（常见于女性），具有频繁的染色体不稳定和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）缺失，以上调的OXPHOS和其他代谢通路为标志。亚型2（肺泡样）主要是EGFR突变、基因组稳定的LUAD，具有低TP53突变/TMB负荷，并且还富集白细胞介素-33（IL-33）和Notch通路磷酸化。它与早期、致癌基因驱动的肺泡分化表型一致。亚型3（增殖型）主要是男性吸烟患者中的LSCC，是一种染色体不稳定、肿瘤抑制缺陷的增殖亚型，以TP53突变以及细胞周期通路的强烈上调为特征。亚型4（缺氧/间质型）转移频率高，显示缺氧通路激活和Notch信号传导。它在染色体上稳定，具有间质表型，并与最差的预后相关。亚型5（免疫原性），一种KRAS突变和免疫“热”亚型，以高肿瘤浸润淋巴细胞为特征，预后相对较好。该亚型在接受辅助治疗的患者中生存率最佳。此外，影像组学与基因组学和转录组学的结合揭示了影像表现与TME免疫状态之间的关系，这将有助于肺癌的分类和预测免疫治疗反应。通过影像组学、靶向DNA测序和批量RNA-seq，影像组学定义的聚类重演了LUAD进展——惰性/分化型（聚类1）、发育性但低增殖性（聚类4）以及高增殖性（聚类2-聚类3）——在实性结节中分离了免疫激活（聚类2）和免疫抑制（聚类3）的肿瘤微环境，并产生了一个与早期LUAD预后分层相关的影像组学相关RNA特征。

多组学方法的整合增强肺癌的早期检测

除了分子分类，多模态平台作为更全面的工具，显著增强了NSCLC的早期检测和诊断。其中，通过多组学分析确定的DNA甲基化生物标志物在NSCLC中具有重要的诊断潜力。例如，PulmoSeek Plus模型是一个整合了临床特征、影像组学数据和cfDNA甲基化生物标志物的多组学模型，已被开发用于准确分类肺结节，并促进NSCLC的早期诊断。这种多模态方法展示了强大的诊断性能，在组合集中曲线下面积（AUC）为0.90，灵敏度为0.88，特异性为0.98。另一个基于ctDNA基因组特征、表观遗传特征和其他突变信息的多组学模型已被开发用于早期NSCLC筛查，通过整合基于WGS的cfDNA片段组学、基因组学和cfDNA甲基化组学，在来自多个中心入组的验证集中显示出高特异性（96.3%）并达到AUC为0.912。多重数字甲基化特异性PCR（mdMSP）平台，一个整合了cfDNA甲基化分析和多重数字MSP的多重平台，已被开发用于以高灵敏度和特异性区分NSCLC（SOX17、CDO1、TAC1和HOXA7）。这种多模态方法在临床性能中实现了高灵敏度（90%）和特异性（82%），相应的AUC为0.86。

人工智能（AI）和多模态整合的最新进展显著促进了肺癌早期诊断的增强。影像组学可用于AI范式，结合其他多组学方法，通过多维信息提供非侵入性检测工具，并揭示影像表型、分子机制和临床结果之间的联系。影像组学和表观基因组学特征（DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质可及性）的整合可以捕捉肺部病变的细微差异，并检测早期肺癌的分子变化，提高筛查的敏感性和特异性。例如，Clinic-RadmC是一个多组学模型，结合了临床数据、片段组学谱、表观基因组学和影像组学特征，通过深度学习技术优化了对不确定肺结节的诊断准确性。这种非侵入性策略实现了0.923的AUC，超越了许多单组学模型。此外，影像组学与代谢组学的结合通过LC-MS/MS将代谢重编程与影像学发现相关联，并发现了代谢-免疫微环境的非侵入性检测生物标志物。基于深度学习的多组学平台整合了血清代谢指纹与常规临床指标（如癌胚抗原（CEA）和通过纳米颗粒辅助激光解吸/电离质谱（NPLDI-MS）和影像组学获得的图像特征），已证明AUC为0.778，灵敏度为81.79%，突出了AI和多组学癌症生物标志物结合在开发多模态平台方面的附加价值。这些多重检测与AI驱动分析策略的整合在增强早期LUAD诊断和完善肺结节分类方面具有巨大潜力。

呼出气和挥发物组学分析也已成为肺癌早期检测有前途的非侵入性方法。呼出气生物标志物，包括细胞、DNA片段和挥发性有机化合物，可以使用先进技术如质谱法、气相色谱法和电子鼻进行分析，这些技术在早期肺癌检测中已显示出高诊断性能，诊断率达到86%，F1分数高达92.5%。其诊断准确性与临床I期肺癌的组织病理学结果非常吻合，表明其未来可能与影像学或其他组学方法一起构成多组学模型。此外，支气管微生物组分析促进了基于微生物的分类器的开发，用于NSCLC的风险预测和早期检测。这种方法利用与肺癌发病机制相关的独特微生物特征，进一步扩展了多组学驱动诊断的范围。

多组学分析促进肺癌精准治疗生物标志物的应用

基因突变如TP53、KRAS和BRAF突变以及程序性死亡配体-1（PD-L1）蛋白表达在预测肺癌免疫治疗反应方面已显示出有希望的结果。然而，PD-L1表达在空间和时间上都是异质性的，并且可能在不同的肿瘤阶段和转移部位之间变化，使其作为独立生物标志物的可靠性较低。此外，单生物标志物方法通常表现出较低的灵敏度，并且无法提供临床数据的全面视图。多组学方法通过整合多层分子信息，提供了一种更强大的策略。肺癌生物标志物的发现，当通过多模态方法整合时，将为跟踪预后、理解耐药机制和优化肺癌免疫治疗反应预测提供更强大的策略。

多组学分析促进对肺癌耐药性的理解

多组学策略在识别与肺癌耐药相关的生物标志物方面发挥着至关重要的作用。与免疫治疗耐药相关的TME其特征是抗肿瘤免疫反应不足，突出了免疫相关细胞作为耐药预测生物标志物的潜力。例如，通过scRNA-seq和空间转录组学分析，分泌磷蛋白1阳性（SPP1⁺）巨噬细胞、XI型胶原α1链阳性癌症相关成纤维细胞（COL11A1⁺ CAFs）和失活的三级淋巴结构（TLSs）可能作为NSCLC免疫检查点阻断（ICB）-化疗前后TME中与不良预后相关的生物标志物。SPP1⁺巨噬细胞和肿瘤细胞与COL11A1⁺ CAFs共定位，刺激胶原纤维在肿瘤边界沉积和缠结，阻碍T细胞浸润，导致NSCLC预后不良。TLSs分为四个阶段：早期淋巴聚集TLSs（LTi标志物高表达，细胞因子低表达）、活化TLSs（细胞因子高表达）、衰退TLSs（细胞因子表达减少）和晚期TLSs（细胞因子表达极低）。独立队列显示活化的TLS与更好的总生存期（OS）相关。此外，特定的信号通路和蛋白质可以成为与耐药相关的生物标志物。乙酰胆碱（ACh）代谢已成为NSCLC靶向治疗中对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗产生耐药耐受所涉及的生物标志物。通过整合RNA-seq和LC-MS/MS，ACh在耐药持久细胞中特异性积累，部分通过ACh毒蕈碱受体3（M3R）经由WNT信号传导导致EGFR-TKI治疗中的耐药耐受。并且发现达非那新（darifenacin），一种FDA批准的M3R抑制剂，在体内显著减少肿瘤复发。另一项多组学分析暗示IFNγ在NSCLC中对PD-L1阻断获得性耐药中的作用。WES、RNA-seq和scRNA-seq分析表明，对PD-L1阻断的获得性耐药与IFNγ相关基因表达升高、OXPHOS和DNA修复通路反应以及TME中的慢性炎症状态相关，进一步强调了免疫治疗敏感性和耐药性的复杂机制。

多组学分析促进发现肺癌预后生物标志物

多组学分析在发现有助于预测肺癌临床结果的新生物标志物方面显示出前景。在早期NSCLC中，近期的治疗突破已证明在延长OS方面有所改善。一项整合了WES和RNA-seq的多组学研究确定了B细胞易位基因2（BTG2），一种肿瘤抑制蛋白，作为早期NSCLC的稳定预后生物标志物。BTG2表达在各个队列中始终与改善的生存率相关，风险比（HRs）范围在0.28到0.68之间。除了早期疾病，多组学方法对于监测晚期肺癌也很重要。例如，通过scRNA-seq和Olink蛋白质组学分析确定的表面活性蛋白B（SP-B）特异性IgG自身抗体和CD4⁺ T细胞的预处理水平，可能作为预测发生ICI诱导的免疫相关不良事件（irAEs）可能性的潜在生物标志物。近期也确定了预测SCLC临床结果的生物标志物。例如，RE1沉默转录因子（REST），一个与神经元分化相关的重要转录调节因子，可能作为低NE SCLC生存的预测生物标志物。通过整合scRNA-seq和数字空间分析（DSP），在多维度上充分描绘了SCLC中的NE特征和免疫浸润异质性。低NE肿瘤与免疫浸润（包括M1和M2样巨噬细胞、B细胞、单核细胞和CD4⁺/CD8⁺ T细胞）密切相关，表明预后较好。这些免疫细胞大多位于肿瘤巢周围区域。在肿瘤巢内，高比例的肿瘤浸润B细胞可能与低TLS形成和较差的OS相关。

多组学分析促进预测肺癌复发

多组学生物标志物在揭示肺癌复发机制方面起着至关重要的作用。预测后续复发的亚克隆性质可以显著促进旨在预防亚克隆驱动的肺癌复发的精准辅助疗法的发展。一项整合的多组学研究，结合了WES、RNA-seq、scRNA-seq和DNA甲基化分析，在多维度上展示了复发性I期NSCLC患者肿瘤内细胞和TME的改变景观，并将患者分为4个亚簇进行预测。基因组不稳定性（如TP53突变）和DNA低甲基化（如黑色素瘤优先表达抗原（PRAME））作为遗传和表观遗传生物标志物促进了复发性I期NSCLC。TME的改变在肺癌复发中也至关重要，其特征是AT2来源的恶性细胞、耗竭的CD8⁺ T细胞和SPP1⁺巨噬细胞的富集。此外，与复发性I期NSCLC相关的4个亚簇被分为高风险（nmf1， nmf2）、中风险（nmf3）和低风险（nmf4），以减少复发并指导精准治疗。nmf1亚型以血管生成富集和最高的耗竭评分为特征。nmf2亚型显示MYC靶点、G2M检查点通路的显著激活。nmf3亚型显示EGFR高突变。

AI驱动的多模态整合促进肺癌管理

AI驱动的多模态整合在精准肿瘤学领域具有前景，可增强肺癌的治疗反应预测或复发预测。影像组学与基因组学的整合将影像特征与通过WES/WGS识别的驱动基因突变（如EGFR、KRAS和TP53）相结合，有助于以非侵入性方法预测基因突变状态以及ITH，并协助动态风险评估和个性化用药决策。一个整合了医学影像、组织病理学和基因组学特征的多模态框架预测了NSCLC患者对PD-L1阻断的反应。这个多模态模型在247名患者中实现了0.80的AUC，超过了单模态测量，包括TMB（A