200 kV冷冻电镜实现哺乳动物细胞原位结构分析——推动冷冻电子断层扫描技术普及的新策略

《BMC Methods》：In situ structural analysis of mammalian cells using a 200 kV electron cryomicroscope – implications for research infrastructure

本研究针对高成本300 kV冷冻电镜限制冷冻电子断层扫描（cryoET）技术普及的问题，系统评估了200 kV冷冻电镜在哺乳动物细胞原位结构研究中的适用性。研究人员利用Glacios G1冷冻电镜对U2OS细胞进行成像分析，成功获得了纳米级分辨率的细胞三维结构图谱，并对脂滴（LDs）进行了分子社会学研究。结果表明200 kV冷冻电镜无需能量过滤器即可获得有价值的cryoET数据，为推广该技术在结构细胞生物学中的应用提供了重要依据。

　　

在结构生物学领域，冷冻电子显微镜（cryoEM）技术的"分辨率革命"已过去十年，单颗粒分析（SPA）技术成功解析了大量纯化蛋白质的高分辨率结构。然而，生物功能并非由孤立分子执行，而是源于蛋白质、核酸和脂质等细胞组分间的复杂相互作用网络。因此，对未受干扰的细胞环境进行原位结构研究的需求日益增长。

冷冻电子断层扫描（cryoET）作为一种重要的cryoEM技术，能够在接近原生状态下获得细胞环境的三维分子分辨率图像，被称为"视觉蛋白质组学"。当目标结构在断层图中存在多个拷贝时，还可通过亚断层图平均获得近原子分辨率重建。然而，细胞cryoET面临的主要挑战是样品厚度限制，通常需要配备能量过滤器的高端300 kV透射电镜，这类仪器价格昂贵、维护成本高，主要集中在少数大型研究中心，限制了该技术的普及。

在此背景下，Piotr Szwedziak的研究团队在《BMC Methods》上发表了一项具有重要意义的研究，系统评估了200 kV冷冻电镜在细胞cryoET中的应用潜力。研究人员提出一个关键问题：更简单、更便宜的200 kV仪器能否为细胞cryoET应用提供有意义且可解释的数据？

研究人员采用Glacios G1冷冻电镜配合Falcon 3EC相机（无能量过滤器），对U2OS人骨肉瘤细胞的薄边缘进行了cryoET成像。实验设计基于一个重要理论：200 kV电子的非弹性散射平均自由程约为260 nm，而先前研究表明，在没有能量过滤器的情况下，有用数据可收集至两倍平均自由程厚度。研究团队精心优化了数据采集策略，采用相对高散焦（-5至-7 μm）和高总剂量（140 e^-/?²）以增强对比度，大像素尺寸（5.1 ?）以获得更广阔的细胞环境视野。

研究结果显示，获得的断层图质量足以清晰识别细胞内容物并观察大分子间的空间相互关系。通过机器学习辅助分割，研究人员成功识别了微管、中间纤维、线粒体双膜、核糖体等细胞结构，并构建了详细的细胞超结构图谱。特别值得注意的是，研究对脂滴（LDs）进行了深入的分子社会学分析，揭示了它们与内质网（ER）、微管、线粒体等细胞器的空间关系和相互作用模式。

研究发现，在观察到的231个脂滴中，69%与内质网保持密切接触，29%的脂滴彼此直接接触，40%与微管相互作用。更重要的是，研究首次在分子分辨率下直接观察到脂滴表面存在COPI和网格蛋白等膜运输蛋白复合物，为理解脂滴生物学提供了新的结构见解。

此外，研究人员还对纯化的大肠杆菌70S核糖体进行了亚断层图平均，获得了约15 ?分辨率的三维重建，证明200 kV冷冻电镜也能用于中等分辨率的结构研究。

通过对全球高端冷冻电镜平台分布和科学产出的分析，研究发现200 kV仪器在cryoET应用中严重未充分利用。截至2024年8月，Glacios平台在2023年仅贡献了4个cryoET相关的EMDB条目，而Krios平台则有837个。这种利用率差异部分源于300 kV仪器通常集中在国家级核心设施，而200 kV仪器分布更广，为技术民主化提供了可能。

主要技术方法包括：使用Quantifoil金网格培养U2OS细胞并通过 plunge-freezing 技术实现玻璃化冷冻；利用Thermo Scientific Glacios G1冷冻电镜（200 kV）配合Falcon 3EC探测器进行断层序列采集；采用IMOD和EMAN2等软件进行断层重建、分割分析和亚断层图平均。

CryoET成像哺乳动物细胞

研究人员对64个U2OS细胞进行了成像，获得了近230个断层图，平均厚度为240±75 nm。通过对比度传递函数（CTF）拟合评估显示，数据质量与局部细胞厚度呈线性相关，证明200 kV冷冻电镜无需能量过滤器即可获得可靠的cryoET数据。

天然细胞环境的分子图谱

断层图质量足以识别所有主要细胞结构，包括三种细胞内纤维（微管、中间纤维、肌动蛋白）与内质网膜结构和核糖体颗粒的相互交织。通过神经网络识别并自动提取约1500个核糖体颗粒进行亚断层图平均，获得了38 ?分辨率的三维重建。结合各种细胞组分的分割结果，生成了完整的细胞三维分子图谱。

细胞器超微结构鉴定

研究成功识别了多种细胞器：线粒体具有典型的嵴结构（测量宽度为12.8 nm）和钙磷酸盐包裹体；蛋白质包被的囊泡/芽，可能为早期内体，平均直径55±7 nm；广泛的核糖体包被的内质网网络；以及与微管紧密相互作用的核糖体相关囊泡（RAVs），其通过8 nm直径的膜管相互连接。

脂滴的详细分析

对231个脂滴的分析显示其平均直径为205±70 nm，具有典型的单层磷脂表面。脂滴常形成簇状，并与内质网保持密切关联。研究发现5.6%的脂滴位于内质网腔内，这是哺乳动物脂滴家族中特征最少的成员。脂滴与多种细胞器相互作用：3%与线粒体关联，40%与微管接触，1.7%与推定溶酶体和多泡体（MVBs）相互作用。

膜运输蛋白与脂滴的直接相互作用

研究首次在分子分辨率下观察到脂滴表面存在COPI和网格蛋白包被。COPI诱导的膜变形可能有助于建立脂滴与外内质网膜之间的连续膜桥，而网格蛋白的典型三腿蛋白构建块组装成五边形和六边形晶格结构。

研究结论强调，200 kV冷冻电镜无需能量过滤器即可获得有价值的细胞cryoET数据，为推广该技术在结构细胞生物学中的应用提供了实验依据。鉴于200 kV仪器在多功能性与成本方面的有利比率，它们有望成为本地冷冻电镜设施的主力设备。这种"一级访问"设施将极大促进cryoEM技术的民主化，与提供尖端成像技术的"二级访问"国家级设施形成互补，共同推动原位结构生物学的发展。

这项研究的重要意义在于，它为资源有限的研究机构开展细胞cryoET研究提供了可行方案，有望促进更广泛科研群体参与原位结构生物学研究，从而推动对细胞功能分子基础的理解。随着针对低电子能量优化的电子探测器的发展，200 kV仪器的性能和重要性将稳步提升。