铜死亡相关基因在葡萄膜黑色素瘤中的预后评估与分子分型：基于多数据库整合分析与实验验证

《Cancer Cell International》：Prognostic evaluation and experimental validation of cuproptosis-related hub genes identified through weighted gene co-expression network analysis in uveal melanoma

本研究针对葡萄膜黑色素瘤(UVM)预后差、治疗选择有限的问题，通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定铜死亡相关基因(CRGs)，构建包含8个关键基因的预后模型CRG_score(AUC=0.895)。研究发现UVM患者可分为两个具有显著生存差异的铜死亡分子亚型，证实铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl2可通过引起G2/M期阻滞、促进凋亡和活性氧(ROS)积累抑制UVM细胞增殖，为UVM的个体化治疗提供了新的生物标志物和治疗策略。

　　

葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma, UVM)是成人中最常见的原发性眼内恶性肿瘤，虽然发病率相对较低，但其恶性程度高，约50%的患者会发生转移，一旦发生转移，中位生存期仅为6-12个月。更令人担忧的是，与传统皮肤黑色素瘤(Cutaneous Melanoma)对免疫检查点抑制剂治疗的良好反应不同，葡萄膜黑色素瘤对当前主流免疫治疗方案的响应率有限，这与其独特的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)和分子特征密切相关。因此，深入探索葡萄膜黑色素瘤发生发展的分子机制，寻找新的预后生物标志物和潜在治疗靶点，成为当前研究的热点和难点。

近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——铜死亡(Cuproptosis)的发现为肿瘤研究开辟了新视角。铜死亡不同于已知的细胞凋亡(Apoptosis)、铁死亡(Ferroptosis)、焦亡(Pyroptosis)和坏死性凋亡(Necroptosis)，它是由细胞内铜离子稳态失衡直接触发的。铜作为人体必需的微量元素，参与多种重要的生物学过程，包括能量代谢和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的清除。研究表明，铜离子可通过直接结合三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle, TCA Cycle)中脂酰化的组分，导致脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白丢失，进而引发蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。值得注意的是，多种肿瘤组织中的铜水平显著高于正常组织，提示铜代谢紊乱与肿瘤发生发展可能存在密切联系。然而，铜死亡在葡萄膜黑色素瘤中的作用及其与肿瘤微环境、患者预后的关系尚不明确。

为了解决这一问题，Chen等研究人员在《Cancer Cell International》上发表了题为“Prognostic evaluation and experimental validation of cuproptosis-related hub genes identified through weighted gene co-expression network analysis in uveal melanoma”的研究论文。该研究旨在系统揭示铜死亡相关基因在葡萄膜黑色素瘤中的表达模式、临床意义及其对肿瘤微环境的调控作用。

为了开展这项研究，研究人员整合了来自TCGA和GEO数据库的四个独立葡萄膜黑色素瘤数据集（共221例样本）的转录组数据和临床信息。他们首先从分子特征数据库(Molecular Signatures Database, MSigDB)和已有文献中收集了169个铜死亡相关基因以及13个经过实验验证的铜死亡核心基因，通过加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA)筛选出与葡萄膜黑色素瘤密切相关的33个铜死亡相关基因(Cuproptosis-Related Genes, CRGs)。随后，利用共识聚类(Consensus Clustering)根据这33个基因的表达谱将患者分为两个不同的分子亚型（铜死亡簇A和B），并分析了亚型间的临床病理特征、预后差异、免疫细胞浸润和免疫检查点表达。通过差异表达分析识别出1306个亚型相关差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，并进一步利用LASSO Cox回归构建了一个包含8个关键基因的预后评分模型——CRG_score。研究还通过基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)、基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis, GSVA)以及单样本基因集富集分析(single-sample GSEA, ssGSEA)等方法深入探索了CRG_score与肿瘤微环境、信号通路和化疗药物敏感性的关联。最后，通过细胞实验（包括CCK-8法、EdU assay、流式细胞术检测细胞凋亡与周期、ROS检测以及qRT-PCR）在体外验证了铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl₂对葡萄膜黑色素瘤细胞系（M619和92-1）的影响。

研究结果

1. 葡萄膜黑色素瘤中铜死亡相关基因的鉴定与分子亚型分析

研究人员通过整合分析，最终确定了33个与葡萄膜黑色素瘤相关的铜死亡基因。基于这些基因的表达谱，221例患者被清晰地划分为两个亚型：铜死亡簇A（n=87）和铜死亡簇B（n=134）。主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)证实了两个亚型在转录组水平存在显著差异。生存分析显示，铜死亡簇A的患者总生存期(Overall Survival, OS)显著优于簇B的患者，表明铜死亡相关基因的表达模式具有重要的预后指示价值。

2. 铜死亡分子亚型与肿瘤微环境特征

对两个铜死亡亚型的肿瘤微环境进行深入剖析发现，铜死亡簇B呈现出“免疫豁免”表型的特征。尽管该簇患者的肿瘤微环境中浸润了大量的免疫细胞（如活化的B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、树突状细胞等），并且免疫评分和基质评分均较高，但其预后反而更差。通路富集分析显示，铜死亡簇B中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)信号通路显著激活，同时免疫检查点分子（如PD-1, PD-L1, CTLA-4）的表达也更高。这表明，簇B患者肿瘤周围可能存在基质屏障，阻碍了免疫细胞的有效浸润和功能发挥，从而导致了免疫逃逸和不良预后。

3. 铜死亡相关预后模型CRG_score的构建与验证

为了实现对患者预后的个体化评估，研究团队从铜死亡亚型相关的差异表达基因中，通过LASSO Cox回归筛选出8个最具预后价值的基因（NICN1, TCF12, MAPKAPK3, JAG2, PLXNB1, NKIRAS1, P4HA1, SAP30），构建了CRG_score预后模型。根据CRG_score的中位数，患者被分为低风险组和高风险组。生存分析表明，低风险组患者的总生存期显著优于高风险组。受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲线分析显示，该模型在预测1年、3年和5年生存率时的曲线下面积(Area Under the Curve, AUC)分别达到0.710、0.870和0.895，显示出卓越的预测性能。该模型在TCGA-UVM、GSE22138、GSE44295和GSE84976四个独立数据集中均得到了有效验证。

4. CRG_score与肿瘤微环境、基因突变及药物敏感性的关联

分析显示，高风险CRG_score与免疫细胞高浸润、高免疫/基质评分以及高频的BAP1和GNA11基因突变（与不良预后相关）显著相关。而低风险组则与GNAQ、SF3B1和EIF1AX等预后较好相关的基因突变频率更高。在药物敏感性方面，低风险组患者对多柔比星(Doxorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、阿糖胞苷(Cytarabine)和依托泊苷(Etoposide)等化疗药物表现出更高的敏感性（IC₅₀值更低），为临床用药选择提供了参考。单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)分析进一步证实，构成CRG_score的8个模型基因在葡萄膜黑色素瘤细胞中特异性高表达，凸显了该评分模型针对肿瘤细胞本身的特性。

5. 铜死亡在葡萄膜黑色素瘤细胞中的实验验证

体外细胞实验证实，铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl₂能以浓度依赖的方式显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞系M619和92-1的活力（IC₅₀分别为201.2 nM和94.5 nM）和增殖能力。其作用机制包括：诱导细胞周期G2/M期阻滞、促进细胞凋亡、以及引起细胞内活性氧的大量积累。qRT-PCR检测发现，elesclomol-CuCl₂处理后，铜死亡关键基因FDX1的表达上调，而ATP7B和GCSH的表达下调，这与已知的铜死亡机制相符。更重要的是，铜死亡抑制剂四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate, TTM)能够逆转elesclomol-CuCl₂对细胞活力的抑制作用，直接证明了铜死亡的发生。

研究结论与意义

本研究通过生物信息学与实验验证相结合的策略，系统性地揭示了铜死亡在葡萄膜黑色素瘤中的关键作用。研究的主要结论和意义在于：

首先，研究鉴定出33个与葡萄膜黑色素瘤相关的铜死亡基因，并据此将患者分为两个具有显著预后差异的分子亚型。这不仅深化了对葡萄膜黑色素瘤异质性的理解，也为基于分子分层的精准治疗提供了理论依据。

其次，构建的八基因预后模型CRG_score具有优异的预测性能，且在多个独立数据集中得到验证。该模型作为一个稳健的预后工具，有助于临床医生更准确地评估患者预后，识别高危人群，从而制定个体化的随访和治疗方案。

第三，研究深入揭示了铜死亡分子亚型及CRG_score与肿瘤微环境特征的紧密联系，特别是高风险组所呈现的“免疫豁免”表型（VEGF通路激活、免疫检查点高表达、基质屏障）。这一发现提示，对于此类患者，单纯的免疫检查点抑制剂治疗效果可能有限，而联合抗血管生成药物（如VEGF抑制剂）或靶向肿瘤基质的疗法，可能是一种更有前景的治疗策略。

最后，细胞实验证实铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl₂能有效抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长并诱导其死亡，这为开发靶向铜死亡的新型疗法提供了直接的实验证据和潜在的药物候选。

综上所述，该研究极大地丰富了人们对铜死亡在葡萄膜黑色素瘤中作用的认识，所构建的CRG_score模型和提出的分子分型策略，对于改善葡萄膜黑色素瘤患者的预后评估、指导临床治疗决策以及开发新的靶向疗法均具有重要的理论和实践意义。