靶向PIM3激酶逆转缺氧诱导的CAR-T细胞代谢重编程增强实体瘤治疗效果

《Journal of Translational Medicine》：Metabolic reprogramming through PIM3 inhibition reverses hypoxia-induced CAR-T cell dysfunction in solid tumors

本刊推荐：为解决实体瘤缺氧微环境导致CAR-T细胞功能障碍的难题，Zhou等开展"PIM3抑制逆转缺氧诱导CAR-T细胞功能障碍"研究。发现缺氧通过PIMIM3介导代谢重编程（糖酵解增强/氧化磷酸化减弱）导致CAR-T细胞衰竭，基因/药物抑制PIM3可恢复线粒体代谢、增强记忆表型，显著提升CAR-T在实体瘤模型中的抗肿瘤活性。该研究为改善CAR-T实体瘤疗效提供新靶点。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法如同一位"超级战士"，在血液肿瘤治疗中取得了突破性进展。自2017年首个CAR-T产品获得美国FDA批准以来，已有6款针对CD19或BCMA的CAR-T细胞药物上市，为无数血液肿瘤患者带来了新生希望。然而，当这位"超级战士"转战实体瘤战场时，却遭遇了重重阻碍——实体瘤内部特有的缺氧微环境就像一片"死亡沼泽"，严重削弱了CAR-T细胞的战斗力。

实体瘤由于细胞快速增殖、血管分布异常，其内部氧气浓度往往低于1%，形成慢性缺氧区域。这种缺氧条件不仅直接抑制T细胞功能，还能通过上调肿瘤细胞表面的免疫检查点分子（如PD-L1）、促进免疫抑制性代谢产物积累等多种机制，构建起一道坚实的"防护盾"。更棘手的是，缺氧会诱导T细胞代谢重编程，迫使它们从高效的能量工厂——氧化磷酸化（OXPHOS）转向低效的"应急供能模式"糖酵解，导致CAR-T细胞能量不足、功能衰竭。尽管已有研究尝试通过改造CAR结构（如添加缺氧响应元件）来应对这一挑战，但缺氧影响CAR-T细胞的确切分子机制仍不清楚，亟需开发更有效的策略来突破这一瓶颈。

针对这一关键科学问题，南京师范大学周牧野团队在《Journal of Translational Medicine》发表了重要研究成果。研究人员通过系统分析缺氧条件下CAR-T细胞的转录组和代谢特征，发现了一个此前未被充分重视的关键靶点——PIM3激酶，并证实抑制PIM3能够通过逆转代谢重编程显著增强CAR-T细胞在缺氧环境中的抗肿瘤能力。

研究团队采用的主要技术方法包括：利用三气培养箱建立体外缺氧模型（1% O₂），通过流式细胞术评估CAR-T细胞表型和功能，采用Seahorse能量代谢分析仪检测细胞代谢特征，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PIM3敲除CAR-T细胞，并建立人源肿瘤异种移植小鼠模型进行体内疗效验证。所有T细胞均来源于健康供者外周血单核细胞（PBMC）。

缺氧损害CAR-T细胞存活、记忆表型和细胞毒功能

研究人员首先发现，在1%缺氧条件下培养6天的抗MSLN（间皮素）CAR-T细胞增殖完全停滞，凋亡率显著增加。记忆T细胞亚群分析显示，缺氧导致干细胞记忆T细胞（T_SCM）和中央记忆T细胞（T_CM）比例下降，而终末效应T细胞（T_TE）比例上升。功能上，缺氧CAR-T细胞表面脱颗粒标志CD107a和干扰素-γ（IFN-γ）分泌均显著降低，表明其细胞毒功能受损。

缺氧降低CAR-T细胞的短期和长期抗肿瘤功效

在短期杀伤实验中，缺氧预处理的CAR-T细胞对多种肿瘤细胞系（SKOV3-MSLN-luc、OVCAR3-luc等）的杀伤能力均显著下降。更值得注意的是，在多轮长期杀伤实验中，缺氧CAR-T细胞随着刺激轮次的增加，杀伤能力持续减弱，同时记忆表型进一步丢失，细胞因子（IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B）分泌减少，表明缺氧严重损害了CAR-T细胞的持久战斗力。

缺氧诱导功能相关基因差异表达和CAR-T细胞代谢重编程

RNA测序分析揭示了缺氧CAR-T细胞的全局转录组变化：缺氧响应通路和HIF-1信号通路显著激活，同时T细胞功能相关基因下调，耗竭相关基因上调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示代谢通路发生显著改变，糖酵解相关基因上调，氧化磷酸化相关基因下调。

Seahorse代谢分析证实了这一发现：缺氧CAR-T细胞的氧消耗率（OCR）显著降低，质子挤出率（PER）升高，PER/OCR比值增加，表明代谢模式从氧化磷酸化向糖酵解转变。这种代谢重编程与CAR-T细胞衰竭和终末分化密切相关。

PIM3抑制剂AZD1208逆转缺氧诱导的损伤并增强CAR-T细胞疗效

在缺氧上调的基因中，研究人员重点关注了LGMN、PIM3和HK2。通过抑制剂筛选发现，PIM激酶抑制剂AZD1208处理能显著提高缺氧CAR-T细胞的中央记忆表型比例，降低凋亡率，并增强长期杀伤能力。在抗CD70 CAR-T细胞中也验证了AZD1208的类似效果，表明PIM3抑制的益处在不同CAR-T产品中具有普适性。

PIM3敲除CAR-T细胞抵抗缺氧诱导的损伤并在体外体内表现出强大的抗肿瘤活性

为明确PIM3的特异性作用（AZD1208为PIM激酶泛抑制剂），研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了PIM3敲除（KO）CAR-T细胞。结果显示，PIM3 KO不仅能增强常氧下CAR-T细胞的记忆表型和长期杀伤能力，更能显著抵抗缺氧诱导的功能损伤。在三维肿瘤球体杀伤实验和体内小鼠模型中，PIM3 KO CAR-T细胞均表现出更强大的肿瘤清除能力，所有接受治疗的荷瘤小鼠均实现肿瘤完全消退，而野生型CAR-T组仅部分小鼠有效。

PIM3敲除CAR-T细胞显示氧化磷酸化增加和糖酵解减少

机制上，PIM3 KO逆转了缺氧诱导的代谢重编程：缺氧条件下，PIM3 KO CAR-T细胞的线粒体呼吸（基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力）和ATP产量均显著增强，而糖酵解水平降低。基因表达分析显示，多个糖酵解相关基因（MCT4、HK2、ENO2等）在缺氧诱导下的上调被PIM3 KO抑制。

这项研究首次系统揭示了PIM3在缺氧诱导CAR-T细胞功能障碍中的核心作用，并证实靶向PIM3可通过逆转代谢重编程增强CAR-T细胞记忆表型和持久抗肿瘤能力。与既往主要聚焦于CAR结构改造的策略不同，该研究从细胞内信号调控角度出发，为改善CAR-T实体瘤疗效提供了新思路。将PIM3抑制策略整合到CAR-T细胞制造过程中，有望突破实体瘤缺氧微环境这一主要障碍，扩展CAR-T细胞疗法的应用范围。未来研究可进一步探索PIM3抑制与现有缺氧响应CAR设计的联合应用，以及其在临床规模CAR-T生产中的可行性和安全性。