综述：创新基因工程策略解决细胞治疗中的肿瘤抗原逃逸

《Journal of Translational Medicine》：Innovative gene engineering strategies to address tumor antigen escape in cell therapy

本综述系统阐述了肿瘤抗原逃逸的六大机制（基因突变、抗原加工缺陷、谱系转换、抗原重分布、胞啃作用和自体制造污染），并重点介绍了多特异性CAR（双/串联CAR）、BiTE、适配体CAR、synNotch回路、抗原上调策略（mRNA疫苗/表观药物）及非常规T细胞（iNKT/γδT/MAIT）等前沿对策。文章为设计适应性、通用型、生物标志物引导的逃逸抵抗性免疫治疗平台提供了决策框架。

　　

肿瘤抗原逃逃逸的生物学机制

肿瘤抗原逃逸是CAR工程化细胞疗法提升肿瘤杀伤疗效的主要障碍之一。恶性细胞通过六种关键途径实现免疫逃逸：抗原基因突变或选择性剪接、抗原加工缺陷、谱系转换、抗原重分布、胞啃作用导致的表位掩蔽，以及自体CAR-T制造过程中的污染性掩蔽。

遗传改变如点突变、缺失和肿瘤抗原基因的选择性剪接可破坏免疫识别。在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中，CD19靶向CAR-T细胞疗法会筛选出表达缺失关键表位CD19剪接变体的肿瘤细胞。△外显子2变体缺失CD19的胞外表位，而△外显子5,6变体则缺失跨膜结构域，均显著降低CD19在肿瘤细胞表面的呈递。除了B-ALL，抗原突变或选择性剪接导致的肿瘤抗原逃逸也见于其他血液恶性肿瘤。在浆细胞瘤复发患者中发现了GPRC5D基因的双等位基因缺失。在T-ALL中，CD7基因外显子1-3的移码或错义突变与抗CD7 CAR-T治疗后抗原阴性复发相关。在实体瘤中，HER2外显子16缺失与乳腺癌曲妥珠单抗耐药相关，而BRAF V600E突变导致黑色素瘤对维莫非尼耐药。

抗原加工缺陷同样导致抗原逃逸。有报道称，使用BiTE治疗ALL的患者出现CD81（一种与CD19、CD21、CD225形成复合物以调控CD19成熟和转运的伴侣蛋白）的缺失。此外，在B-ALL患者接受抗CD19 CAR-T细胞或博纳吐单抗治疗后，发现调节CD19 mRNA多聚腺苷酸尾和稳定性的NUDT21编码蛋白表达升高，导致CD19阴性复发。新兴研究提出了恢复表面靶标展示的方法，例如化学伴侣（如4-苯基丁酸和牛磺熊去氧胆酸）可稳定错误折叠蛋白的构象并促进其从内质网输出。调节CD19-CD81轴也可能有效：在模型系统中，恢复CD81功能或增强CD19-CD81复合物形成的实验性干预改善了CD19表面表达。对于NUDT21驱动的CD19 mRNA选择性多聚腺苷酸化，遗传抑制NUDT21可通过替代多聚腺苷酸化控制增加CD19丰度，并在临床前模型中使B-ALL/原始细胞对CD19 CAR-T或博纳吐单抗重新敏感。

谱系可塑性是另一种逃逸机制，尤其在白血病中。谱系转换是一种罕见但有记载的现象，即白血病细胞在选择性压力下从淋巴样表型转变为髓样表型。这种转化主要由混合谱系白血病（MLL）重排所促进。例如，在MLL重排的B-ALL中，CAR19疗法可诱导向急性髓系白血病（AML）的谱系转换，导致CD19表达缺失和治疗耐药。MLL基因（KMT2A）发生涉及超过80个伙伴基因的易位，编码一种组蛋白甲基转移酶，改变HOX基因表达，特别是调控造血分化的HOXA9。因此，正常调控功能的丧失促进了谱系转化。这种现象在多种背景下被观察到。

抗原重分布（即抗原从细胞膜重新定位到亚细胞区室）而非完全缺失，也有助于肿瘤细胞从治疗性细胞中免疫逃逸。例如，在与CAR19共培养的B-ALL细胞中，活体显微镜显示CD19在免疫突触处聚集，随后发生内化。类似地，靶向HER2、CD20、FLT3、EGFR、CD10、CD22和前列腺特异性膜抗原（PSMA）的抗体已被证明在结合后可诱导各自抗原的内化。这一过程削弱了基于抗体的治疗方法（如BiTE或抗体依赖性细胞毒性（ADCC））的疗效。

胞啃作用是另一种抗原逃逸机制，即免疫细胞与肿瘤细胞物理相互作用，形成免疫突触，导致膜成分（特别是肿瘤抗原）从肿瘤细胞向治疗性细胞双向转移。这一过程产生两个相互关联的后果：它降低了肿瘤细胞上的抗原密度，筛选出难以识别的抗原低表达变体；同时使治疗性细胞装饰有相同抗原，导致它们成为彼此误伤的目标，引发自相残杀。此外，通过获得性抗原进行的持续性低水平CAR接合可维持强直信号并加速耗竭。胞啃作用的具体实例包括CD19、间皮素、BCMA和NKG2D配体等肿瘤抗原向CAR-T或CAR-NK细胞的转移。

一种罕见但具有临床意义的肿瘤抗原逃逸模式源于自体CAR-T疗法制造过程中治疗性细胞被肿瘤细胞意外污染。有研究报道一例B-ALL患者因存在CAR转导的B细胞白血病细胞而复发。这些恶性细胞在T细胞生产过程中被意外转导了CAR，导致CAR构建体与其表面的CD19表位发生顺式结合，从而有效掩盖了CD19，使其逃避免疫监视。

应对肿瘤抗原逃逸的策略：肿瘤抗原靶向受体的多样化

双/多重CAR

为应对肿瘤抗原逃逸，开发了组合性CAR-T细胞策略，如CAR库或鸡尾酒疗法以及双CAR方法。

在CAR库模型中，两种不同的单输入CAR-T细胞产品被分开制造，然后以不同比例同时或序贯输注。虽然临床数据显示出前景，但平行制造独立的CAR-T细胞群在物流上仍具有挑战性。双CAR设计通过共转导、双顺反子载体或串联CAR构建体，使单个T细胞群体表达两种CAR，从而克服了这一限制。从机制上讲，双CAR通过增加信号强度和改善T细胞/靶细胞相互作用来增强疗效，产生协同而非简单的叠加效应。从转化角度看，双靶向在预防抗原缺失复发方面优于混合的单靶向产品。例如，在B-ALL模型中，CD19/CD123双CAR能更好地减少CD19阴性逃逸。临床上，CD19/20或CD19/22双靶向方法在B细胞恶性肿瘤中显示出高完全缓解率。

尽管具有更高的肿瘤杀伤效力，CAR鸡尾酒疗法和双靶向CAR仍存在局限性。平行制造多个单输入产品增加了成本、人力和周转时间，并引入了协调风险。共转导和双顺反子设计增加了遗传负荷，可能导致载体滴度降低、转导效率下降以及两种受体间表达不平衡，这与强直信号和细胞适应性受损有关。

串联CAR

串联CAR（TanCAR）是CAR-T细胞疗法中的一项创新策略，可在单个受体构建体内实现双抗原靶向。与双CAR和CAR库方法类似，TanCAR遵循“或”逻辑，允许T细胞识别和清除表达两种靶抗原中任意一种的肿瘤细胞。然而，与这些策略不同，TanCAR将两个单链可变片段（scFv）整合在一个CAR内，便于同时锚定两种肿瘤相关抗原（TAA）。这种设计增强了肿瘤识别能力，同时保持了单转基因的结构简单性，降低了多基因插入的相关风险。

一项概念验证研究证明了靶向HER2和IL-13Rα2的TanCAR-T细胞在胶质母细胞瘤中的疗效。TanCAR-T细胞表现出优于单靶向CAR的抗肿瘤反应，有效对抗抗原逃逸。值得注意的是，TanCAR的性能优于双CAR和CAR库方法，这可能归因于其同时接合HER2和IL-13Rα2时实现超活化能力。从机制上讲，这种增强的活化与细胞因子产量增加、微管组织中心（MTOC）极化和持续的细胞毒性相关。重要的是，TanCAR-T细胞在肿瘤接合后并未表现出TIM-3、LAG-3或PD-1等耗竭标志物的升高。

除了胶质母细胞瘤，TanCAR策略也在其他恶性肿瘤中探索。EGFRvIII/IL-13Rα2 TanCAR已用于胶质母细胞瘤测试，而ErbB2/MUC1 TanCAR已用于乳腺癌研究。在血液恶性肿瘤中，CD19/CD22 TanCAR在B-ALL临床前模型中显示出疗效，一项2020年评估CD19/CD20 TanCAR治疗难治或复发性B细胞淋巴瘤的临床研究报告了79%的总缓解率、71%的完全缓解率和64%的无进展生存率。2024年，另一项I/II期临床试验报告，BCMA/CD19 tanCAR-T在复发/难治性多发性骨髓瘤患者中达到92%的总缓解率。

尽管tanCAR-T细胞在克服肿瘤抗原逃逸方面展现出前景，但仍存在挑战。具体而言，构建最佳TanCAR构建体需要仔细考虑间隔区长度、连接序列和scFv方向，其设计比单靶向CAR复杂得多。TanCAR构建体也增加了化学、制造和控制（CMC）的要求。例如，较大的载体尺寸可能降低滴度和转导效率。放行检测必须证明效力与机制一致。此外，TanCAR-T细胞增强的活化虽然有利于细胞毒性，但可能增加细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性的风险。靶向多个抗原也引发了对靶向、脱肿瘤毒性的担忧。

BiTE

BiTE是工程化重组蛋白，可同时通过CD3复合物激活细胞毒性T细胞并将其导向肿瘤细胞。这些分子由两个scFv组成，一个靶向T细胞上的CD3受体，另一个靶向TAA。这种双重特异性使BiTE能够物理桥接T细胞和肿瘤细胞，触发T细胞活化及随后的穿孔素/颗粒酶介导的肿瘤细胞凋亡。由于BiTE的功能不依赖于TCR特异性和MHC限制，它们可以通过克服MHC下调这一关键免疫逃逸策略来增强T细胞介导的肿瘤杀伤。

BiTE的一个临床成功例子是博纳吐单抗，它是首个获FDA批准用于治疗ALL的BiTE。它通过连接B细胞特异性抗原CD19和所有T细胞上表达的TCR的恒定CD3ε亚基的结合域来发挥作用。博纳吐单抗在临床中的可行性归因于几个特性。首先，共聚焦显微镜研究证实其可诱导结构正常的免疫突触形成。引导T细胞识别CD19可改善T细胞增殖并触发促炎细胞因子分泌。值得注意的是，博纳吐单抗表现出异常强大的T细胞介导的细胞毒性。此外，由于其单链结构，博纳吐单抗可以大量高效生产。

尽管BiTE具有优势，它们也存在需要进一步研究的局限性。一个主要挑战是肿瘤抗原逃逸。例如，在一项博纳吐单抗临床试验中，四例复发中有两例与CD19阴性肿瘤细胞的出现相关。调节性T细胞（Treg）的频率也会降低BiTE的疗效。由于BiTE激活细胞毒性T细胞以消除肿瘤细胞，肿瘤细胞上免疫抑制标志物（如PD-L1）的上调可抑制T细胞活化并降低疗效。此外，髓外复发也是一个挑战。

适配体分子

基于适配体分子的CAR-T细胞疗法通过将T细胞重定向至桥接肿瘤细胞和CAR的中间适配体分子，而非直接靶向肿瘤抗原，为传统CAR设计引入了额外的模块化层。已出现三大类适配体系统。

Fc结合适配体CAR利用靶向肿瘤抗原的抗体，使用工程化带有Fc结合胞外域（如CD16）的CAR构建体来识别治疗性抗体的Fc区。该策略受益于大量可用的临床批准抗体；然而，抗体糖基化的变异性可能影响CAR接合。此外，与循环IgG的非特异性结合存在脱肿瘤毒性风险。

标签结合适配体CAR采用工程化的胞外域，识别肿瘤靶向分子上化学或遗传附加的标签。平台包括生物素结合域、荧光素标记抗体、酵母或人源肽、基于亮氨酸拉链的zip-CAR系统，以及与SpyTag修饰的适配体形成共价键的SpyCatcher CAR。主要障碍包括非人标签-结合体对的潜在免疫原性，以及在调整亲和力时保持可切换性而不牺牲效力的挑战，以及确保适配体在肿瘤中的足够递送和滞留时间。

双特异性抗体（bsAb）结合CAR使用胞外域与双特异性适配体相互作用，桥接CAR-T细胞和肿瘤细胞。适配体方法提供关键优势， notably一个分子安全开关，可通过滴定适配体可用性动态调节CAR活性，以及开发独立于肿瘤抗原异质性的通用CAR的潜力。

SynNotch受体与合成电路

工程化细胞疗法面临的主要挑战之一是肿瘤抗原表达的动态和异质性，这常导致抗原逃逸和治疗失败。与主要调控输入识别的传统CAR或TCR不同，synNotch受体提供对抗原感知和下游基因表达的模块化控制。这种双重控制使得能够对环境线索进行可编程的、上下文特定的细胞行为。

synNotch系统基于天然Notch信号机制构建，其中配体接合诱导膜内蛋白酶解和Notch胞内域的释放，后者随后易位至细胞核调节基因表达。合成版本通过工程化胞外域以识别所需抗原，并用人造转录激活因子替换胞内域来重新利用该结构。值得注意的是，synNotch电路在功能上正交于内源信号通路且彼此独立，允许多个独立的synNotch模块在单个细胞内运行。这种模块化便于复杂计算。

这种多功能性已在几个临床前癌症模型中得到利用。例如，设计了靶向胶质母细胞瘤特异性新抗原EGFRvIII或CNS限制性抗原MOG的synNotch受体，其触发针对额外肿瘤相关抗原的CAR表达。在表现出异质性EGFRvIII表达的脑内患者来源异种移植模型中，synNotch调控的CAR-T细胞通过选择性靶向更同质但肿瘤特异性较低的抗原，性能优于传统CAR-T细胞。该结构减轻了强直CAR信号，保留了初始或干细胞样记忆表型，并防止了T细胞耗竭。类似地，在实体癌异种移植模型中，ALPPL2特异性synNotch受体诱导靶向间皮素或HER2的CAR，显示出优于组成型表达CAR的肿瘤控制。

除了直接靶向肿瘤，synNotch平台已被设计赋予治疗性细胞感知疾病相关生物标志物或小分子并响应性分泌治疗性载荷的能力，在体内充当智能递送系统。研究进一步扩展了synNotch的治疗范围，通过改造源自iPSC的NK细胞以识别胶质母细胞瘤细胞表达的免疫抑制配体CD155。接合后，synNotch受体抑制了腺苷介导的免疫抑制的关键外酶CD73，从而增强NK细胞毒性，增加T细胞浸润，并减少肿瘤微环境（TME）内的免疫抑制巨噬细胞群体。

synNotch基于疗法的临床转化正在进行中，一项I期试验（E-SYNC）目前正在评估用于EGFRvIII阳性胶质母细胞瘤患者的自体EGFRvIII特异性synNotch T细胞，该细胞诱导针对EphA2和IL13Rα2的双CAR表达。尽管前景广阔，synNotch也存在技术限制。配体非依赖性活化（LIA）可能由synNotch受体过表达引起，导致脱靶基因表达。为解决此问题，已开发出包含疏水性胞内连接子的增强型synNotch（esNotch）变体，在保持激活保真度的同时将LIA降低超过14倍。此外，synNotch受体本质上依赖于表面结合配体产生的机械力，因此无法检测可溶性线索或在瞬时配体相互作用环境中介导反应。

实际限制包括载荷大小、synNotch驱动CAR诱导的时间依赖性以及配体非依赖性“泄漏”，这些共同要求进行电路功能释放测定，以捕获许可动力学和基础活性，符合FDA关于效力/可比性的指导。临床上，关键风险是抗原低表达正常组织中的误激活（靶向、脱肿瘤）以及高度异质性肿瘤中的活性不足。缓解措施包括根据适应症特异性共表达图谱调整的“与”门设计，在适当情况下采用局部区域递送，以及当治疗中生物标志物显示抗原漂移时预定义重靶向触发器。

具有多重作用机制的替代治疗性细胞群体

iNKT细胞

iNKT细胞代表一类独特的淋巴细胞亚群，通过共表达半不变TCR和NK细胞标志物（如NKp46和CD161）来桥接先天性和适应性免疫。其中，iNKT细胞是主要群体，其特征是具有一个不变TCR α链（小鼠为Vα14-Jα18，人类为Vα24-Jα18），可识别由非多态性、MHC I类样分子CD1d呈递的糖脂抗原。与受多态性MHC分子限制的传统T细胞不同，iNKT细胞的CD1d限制性赋予它们广泛的同种异体反应潜力，并使其能够识别个体间保守的糖脂抗原。

iNKT细胞活化可通过多种机制发生——间接通过细胞因子或CD1d阳性抗原呈递细胞（APC），或直接通过识别CD1d阳性肿瘤细胞呈递的肿瘤相关糖脂抗原。

这种多功能性在肿瘤监视中至关重要，特别是在肿瘤细胞下调MHC分子或呈现应激诱导配体的背景下。然而，肿瘤细胞可通过下调CD1d来逃避免疫。为克服此问题，已证明给予糖脂激动剂（如α-半乳糖神经酰胺）可通过增强CD1d介导的呈递和刺激强大的IFN-γ反应来恢复和增强iNKT细胞介导的抗肿瘤活性。

一旦激活，iNKT细胞部署多种机制发挥抗肿瘤作用：通过穿孔素/颗粒酶或通过NK样受体直接细胞毒杀伤；招募和激活先天性和适应性效应细胞；重塑免疫抑制性TME；以及产生长期免疫记忆。值得注意的是，在神经母细胞瘤等肿瘤中，iNKT细胞可杀伤CD1d阳性肿瘤相关巨噬细胞（TAM），并将M2样抑制性巨噬细胞转化为促炎M1样巨噬细胞，从而减轻TME介导的免疫抑制。

鉴于其强大的免疫刺激和细胞毒性潜力，iNKT细胞正被用于癌症免疫治疗。虽然早期使用游离α-GalCer的方法疗效有限，但随后涉及过继转移体外扩增的iNKT细胞或α-GalCer脉冲的树突状细胞的策略在临床试验中显示出改善的结果。

最有前景的进展之一是CAR-iNKT细胞的开发。与传统CAR-T细胞不同，CAR-iNKT细胞通过其CAR、不变TCR和NK样受体实现三重靶向，提供更广泛、更灵活的肿瘤识别。重要的是，CAR-iNKT细胞已证明具有降低的CRS和移植物抗宿主病（GvHD）风险。一项评估抗CD19 CAR-iNKT细胞治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤的I期临床试验报告了令人鼓舞的早期结果。此外，CAR-iNKT细胞已被证明可通过消耗CD1d阳性TAM和髓源性抑制细胞（MDSC）来重塑免疫抑制性TME。这种双重活性使其能够靶向肿瘤细胞和TME，从而在实体瘤（如卵巢癌、肾细胞癌和胶质母细胞瘤）中实现优于传统CAR-T细胞的肿瘤控制。

γδ T细胞

γδ T细胞因其独特的抗原识别能力和非常规作用模式而在癌症免疫治疗中日益受到关注。结构上，γδ T细胞表达一个由γ和δ链组成的T细胞受体，使其能够独立于MHC分子识别广泛的抗原。这种非MHC限制性识别使γδ T细胞在靶向因抗原丢失或MHC下调而发生免疫逃逸的肿瘤细胞方面具有独特优势。与通常需要抗原呈递和共刺激信号才能完全活化的αβ T细胞相比，γδ T细胞可在单一激活刺激下启动细胞毒性反应，凸显其功能灵活性。一些亚群，如Vδ2 T细胞，甚至充当专业的抗原呈递细胞，促进更广泛的免疫反应并增强与其他免疫区室的交叉对话。

γδ T细胞通过几种机制介导抗肿瘤免疫：通过穿孔素和颗粒酶释放直接细胞毒性；分泌促炎细胞因子如IFN-γ和TNF；以及接合NK样受体（包括NKG2D）以识别应激诱导配体。此外，其MHC非依赖性大大降低了GvHD风险，使其成为过继免疫治疗中有吸引力的同种异体平台。然而，肿瘤诱导的免疫抑制，加上γδ T细胞亚群的功能异质性和可变的组织趋向性，对其治疗一致性和在TME内的持久性构成了障碍。

基于其固有的抗肿瘤特性，γδ T细胞已被基因工程改造为携带CAR，以增强肿瘤特异性和细胞毒性潜力。CAR-γδ T细胞将γδ T细胞的先天样监视和快速效应功能与CAR构建体的精准靶向相结合。临床前模型和早期临床试验已在治疗B细胞淋巴瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌和结直肠癌中显示出前景。然而，几个障碍仍然存在——最显著的是亚群异质性的挑战、体内持久性有限以及需要为γδ T细胞量身定制的有效基因转移技术。

MAIT细胞

MAIT细胞是癌症免疫治疗中的一支新兴力量，为对抗肿瘤抗原逃逸提供了独特的武器库。结构上，MAIT细胞表达一个半不变TCR——由Vα7.2-Jα33与受限的β链库配对组成——可识别由非多态性MR1分子呈递的核黄素衍生微生物代谢物。它们MR1限制性的抗原识别得到MR1非依赖性活化途径的补充，涉及细胞因子如IL-12和IL-18，从而实现广泛而灵活的反应。这种独立于MHC的抗原识别不仅使MAIT细胞能够规避肿瘤逃避肽呈递的机制，而且最大限度地降低了同种异体设置中GvHD的风险。

在激活后——无论是MR1依赖性还是细胞因子驱动——MAIT细胞迅速增殖并部署