基于微流控数字PCR技术实现EV71手足口病的精准早期诊断

《BMC Infectious Diseases》：Identification of enterovirus 71 hand, foot and mouth disease from other enteroviruses by microfluidic digital PCR

本研究针对EV71感染早期病毒载量低导致的RT-qPCR假阴性问题，开发了一种靶向EV71 VP2基因的微流控芯片数字PCR(RT-dPCR)检测方法。该方法灵敏度达7.406 copies/μL，与临床样本比对显示100%符合率(kappa=1.0, p<0.001)，为EV71相关重症手足口病的早期诊断提供了可靠技术支撑。

　　

在儿科传染病领域，手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)一直是中国公共卫生体系面临的重要挑战。这种疾病最初在1981-1997年于上海被发现，表现为传播缓慢的散发病例，随后在20世纪80-90年代，天津、北京等地出现了主要由柯萨奇病毒A16(CV-A16)引起的局部暴发。1998年中国台湾地区的大规模流行标志着肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)作为一种重要病原体的出现。2007-2008年山东临沂和安徽阜阳的严重疫情进一步凸显了EV71的致病性，促使中国在2008年将手足口病列为丙类法定传染病并建立了国家防控体系。

EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，最早于1969年在美国加利福尼亚州分离得到。该病毒不仅引起典型的手、足、口腔黏膜皮疹，严重病例还可进展为神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹。病毒的高传播性和潜在致命性对人口密集和资源有限地区的公共卫生构成了重大挑战。

早期准确检测EV71对疾病管理至关重要。及时诊断能够实现感染者的早期隔离，遏制社区传播，并有助于早期干预以减轻疾病严重程度和并发症。传统诊断方法包括病毒分离、血清学检测和常规聚合酶链反应(PCR)，但这些方法存在灵敏度低、特异性差和定量不可靠等局限性。

尽管PCR技术的进步解决了一些限制，但也带来了新的挑战。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)虽然提高了检测速度和通量，但其依赖标准曲线的特性引入了样本与标准品之间扩增效率变异带来的误差，且临床PCR抑制剂可能导致假阴性结果。多重PCR通过同时检测EV71和相关病原体缩短了检测时间，但优化多靶点反应仍然具有挑战性，存在扩增不均一和非特异性信号的风险。环介导等温扩增(LAMP)技术实现了无需热循环仪的床旁检测，但扩增产物交叉污染和复杂产物结构增加了假阳性风险。

数字PCR(digital PCR, dPCR)作为第三代PCR技术，通过将反应分割成数千个纳升级液滴，实现了不依赖标准曲线的绝对定量，彻底改变了量化方式。本研究开创性地开发了一种基于微流控芯片的RT-dPCR检测方法，靶向EV71的VP2基因，通过评估灵敏度、特异性和临床一致性解决了先前技术的局限性。

研究人员采用了几项关键技术方法：针对EV71 VP2基因设计特异性引物和TaqMan MGB探针；构建pET28a-EV71 VP2标准质粒建立定量标准；使用微流控芯片数字PCR系统(QuantStudio 3D Digital PCR System)进行绝对定量分析；收集60例临床咽拭子样本(包括EV71阳性10例和其他病毒感染50例)进行方法验证；通过灵敏度、特异性和重复性实验全面评估检测性能。

探针和引物

研究人员使用PRIMER EXPRESS Software v3.01设计了靶向EV71 VP2基因(GenBank: HM245928.1)的MGB探针和引物。探针序列为5'-(FAM)-CCTATAACTATCACATTGGC-3'-(MGB)，与正向引物(5'-CAAGGAGCGACGCCAGTAAT-3')和反向引物(5'-TGCGAATTCAGAACACATTGG-3')配对，产生63bp的扩增产物。与GenBank数据库中40株EV71菌株的序列比对证实了设计的引物和探针具有高度保守性。核酸BLAST分析进一步验证了靶基因在100个EV71序列中的保守性。

标准样品的确定

pET28a-EV71 VP2质粒通过琼脂糖凝胶电泳进行表征。图1a显示pET28a-EV71 VP2的大小约为800bp。使用10μM引物和探针通过PCR扩增靶基因。如图1b所示，所得扩增产物大小约为60bp。

定量PCR中引物和探针的最佳浓度

通过一系列定量PCR试验确定最有效的引物和探针浓度。最佳引物储备浓度确定为10μM，最佳探针储备浓度为100μM，此时CT值最低(图2)。除了2-10μM外，还测试了12、14和20μM引物。发现在10μM时CT值最低且没有引物二聚体。优化实验重复3次，每次3个重复。10μM引物浓度下CT值的变异系数小于5%。

qPCR检测在关键指标上表现出稳健性能：

标准曲线：在10⁸-10¹ copies/mL标准品中观察到线性关系(图3a)，回归方程为y=-3.206x+36.6(R²=0.9944)。

灵敏度：检测限为100 copies/mL，低于此阈值时CT值稳定(>33)。

特异性：与CV-A16(n=2)、CV-A6(n=5)、CV-A4(n=2)、CV-A2(n=1)、CV-A10(n=5)、CV-B3(n=1)、H1N1(n=2)、H3N2(n=2)、HCV(n=1)或SARS-CoV-2(n=4)均未观察到交叉反应，所有CT值均>32(图3b)。

重现性：批间变异系数(CV)范围为0.32%至4.93%(图3c-d)，证实了检测的精密度。

EV71芯片数字PCR的标准曲线

图4a-e展示了EV71 cdPCR分析浓度范围为10¹至10⁵ copies/μL的标准质粒模板的结果。测量浓度分别为7.165 copies/μL、51.426 copies/μL、304.24 copies/μL、2511.3 copies/μL和25318.7 copies/μL。蓝色点代表FAM信号。黄色点表示无扩增信号。红色点代表VIC信号。绿色点代表FAM和VIC信号。经过对数转换后，与理论值观察到线性相关性(图4f)。使用GraphPad Prism 7.0，确定cdPCR校准曲线方程为y=0.8785x-0.06496，确定系数(R²)为0.9977，显示出优异的线性。

EV71 cdPCR的灵敏度、特异性和重复性

灵敏度：对10¹ copies/μL标准品进行三次重复测试，平均浓度为7.361、7.430和7.427 copies/μL，计算得出灵敏度为7.406 copies/μL。

特异性：非EV71病原体(CV-A16、CV-A6、CV-A4、CV-A2、CV-A10、CV-B3、H1N1、H3N2、HCV、SARS-CoV-2)的浓度均<0.123 copies/μL(表3；图5)。

重复性：dPCR的平均CV%为1.09%，显著低于qPCR(图6)，证实了其卓越的精密度。

EV71 dPCR与临床诊断的一致性

EV71数字PCR(dPCR)检测在60份临床样本上进行了测试，包括CV-A16(n=12)、CV-A6(n=18)、CV-A4(n=2)、CV-A2(n=1)、CV-A10(n=8)、CV-B3(n=1)、H1N1(n=4)、H3N2(n=4)和EV71(n=10)。检测结果与临床诊断结果进行了比较。所有10例经临床诊断(qPCR)确认的EV71阳性样本均被dPCR鉴定为阳性(表4)。使用dPCR阈值≥7.406 copies/μL，10份样本检测为阳性，50份检测为阴性。通过SPSS进行的统计分析显示灵敏度为100%(10/10)，特异性为100%(50/50)，总符合率为100%(60/60)，kappa值为1.0(p<0.001)，证实了完美的一致性。这些结果验证了dPCR检测方法能够以高准确性区分EV71与其他肠道病毒。

手足口病的诊断依赖于临床检查和实验室分析。医生通过体格检查识别手足口病，注意口腔溃疡和手、足部特征性皮疹等体征。标本(如咽拭子、粪便)的实验室分析对于病原体识别至关重要。然而，早期手足口病可能模仿其他儿童感染(如麻疹)，使非专科医生的诊断复杂化，并增加延迟或不适当治疗的风险。

尽管疫苗开发取得了进展，但对于手足口病尚无普遍有效的预防或治疗选择。灭活EV71和CV-A16疫苗已显示出前景，但在全球标准化、长期有效性和可及性方面面临挑战。因此，快速准确的诊断工具对于减轻疫情暴发仍然至关重要。现有方法，包括病毒培养、ELISA和常规PCR，存在灵敏度低、检测时间长或技术复杂等局限性。

病毒培养虽然是评估病毒存活能力的金标准，但劳动强度大且依赖于病毒完整性。多重PCR和LAMP技术提供了多重检测能力和简化的工作流程，但受到交叉污染风险和复杂产物解释的限制。本研究介绍了一种基于微流控芯片的dPCR检测方法，靶向EV71的VP2基因，解决了传统方法的局限性。

该dPCR检测达到了7.406 copies/μL的灵敏度，比qPCR高10-100倍，并且对非EV71病原体(CV-A16、CV-A6、CV-A4、CV-A2、CV-A10、CV-B3、H1N1、H3N2、HCV、SARS-CoV-2)具有100%的特异性。这些结果与先前强调dPCR在绝对定量和减少抑制效应方面优越性的报告一致。

与临床qPCR的100%一致性(kappa=1.0)强调了其在常规使用中的可靠性。值得注意的是，dPCR的低变异系数(1.09%)超过了qPCR的重现性，最小化了批间变异。这些特性使dPCR在早期EV71检测方面具有前景，特别是在及时干预至关重要的资源有限地区。

本研究提出了一种新型的基于微流控芯片的dPCR检测方法，用于快速、灵敏和特异性地检测EV71。该检测方法具有7.406 copies/μL的检测限和100%的临床一致性，解决了早期手足口病诊断的关键空白。通过克服传统PCR方法的局限性，该技术有望用于EV71监测，实现及时的公共卫生干预并降低疾病发病率。需要在多中心环境中进行进一步验证和成本效益分析，以促进其广泛应用。