高通量筛选与荟萃分析联用：抗疟药物发现中先导化合物鉴定的新策略

《Malaria Journal》：High-throughput screening and meta-analysis for lead compounds in antimalarial drug discovery

本研究针对疟原虫耐药性日益严峻的全球健康挑战，创新性地将表型高通量筛选(HTS)与多参数荟萃分析相结合，从9,547个化合物库中系统筛选出19个先导化合物。其中ONX-0914、甲氨蝶呤(MTX)和锑化合物在体外对氯喹(CQ)和青蒿素(ART)耐药株均显示纳摩尔级抑制活性(IC50<500 nM)，在鼠疟模型中获得95.9%的寄生虫抑制率。该方法为抗疟药物研发提供了高效筛选范式。

　　

在全球公共卫生领域，疟疾依然是威胁人类健康的重大传染病。根据世界卫生组织最新统计，全球每年仍有约2.63亿疟疾病例和59.7万死亡病例。更令人担忧的是，抗疟药物耐药性的持续蔓延已成为疟疾防控的主要挑战。在非洲、美洲和东南亚地区，包括双氢青蒿素-哌喹和青蒿琥酯-阿莫地喹在内的联合用药方案都出现了治疗失败案例，这主要与疟原虫耐药基因突变相关。面对这一严峻形势，开发新型抗疟药物显得尤为迫切。

然而，药物研发是一条漫长而艰辛的道路。从化合物筛选到临床上市平均需要超过十年时间，耗资巨大且成功率低。数据显示，约90%的药物候选物在开发过程中失败，其中先导化合物优化阶段失败率约17%，临床前测试阶段7%，而I期临床试验阶段失败率高达66%。为了突破这一瓶颈，韩国江原大学的研究团队在《Malaria Journal》上发表了一项创新性研究，将高通量筛选与荟萃分析相结合，建立了一套高效识别抗疟先导化合物的新策略。

研究人员首先建立了一套先进的表型高通量筛选平台。他们利用自有的9,547个化合物库，通过SYBR Green I法和图像分析法并行筛选对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株有抑制活性的化合物。这两种方法显示出极强的相关性(r=0.97, p<0.001)，验证了筛选结果的可靠性。初步筛选获得了256个抑制率超过98%的候选化合物。

创新的荟萃分析筛选流程是本研究的一大亮点。研究团队没有立即进行昂贵的体内实验，而是先通过多参数分析对初筛化合物进行优先级排序。他们从PubChem、FDA数据库等资源收集化合物的详细信息，建立了一套综合评估体系：包括抗疟活性(IC₅₀)、安全性(CC₅₀、SI、LD₅₀、MTD)、药代动力学特性(T_1/2、C_max)、新颖性、作用机制和FDA批准状态等指标。这种基于世界卫生组织和疟疾风险投资基金指南的评估方法，最终从256个初筛化合物中优选出了19个最具潜力的先导化合物。

IC100 ( IC10~2 IC50) were selected because of their potential antiplasmodial drug activity.g Distribution of compound clusters based on structural similarity.The numbers indicate the count of compounds within each cluster. Only compounds showing relative potent antiplasmodial activity in each cluster were included.h Mechanisms of action of the compounds. Compounds with novel mechanisms related to malaria were a priority for enrollment'>

关键技术方法包括：建立表型高通量筛选平台评估化合物对恶性疟原虫敏感株和耐药株的抑制活性；采用多参数荟萃分析系统评估化合物的成药性；通过体外溶血实验和细胞毒性实验(CCK-8法)评估化合物安全性；利用柏氏疟原虫(Plasmodium berghei)感染的小鼠模型进行体内药效评价；组织病理学分析评估化合物对主要器官的影响。实验所用疟原虫虫株来自BEI资源库，动物实验使用BALB/c小鼠。

体外抗疟活性验证

研究人员对19个优选化合物进行了系统的体外抗疟活性评估。结果显示，多个化合物对氯喹敏感株(3D7、NF54)和耐药株(K1、Dd2)以及青蒿素耐药株(Dd2-R539T(+)、CamWT-C580Y(+))均表现出强效抑制活性。其中，ONX-0914、氯福克酚、锑化合物、WS3、舒洛地尔和甲氨蝶呤对3D7株的IC₅₀值低于100 nM，显示出极高的抗疟潜力。

特别值得关注的是，ONX-0914对各种耐药株都保持了强劲的抑制活性(IC₅₀值在5.0-22.4 nM之间)，耐药指数均低于0.8，表明其不易产生耐药性。甲氨蝶呤作为一种已知的叶酸代谢抑制剂，对测试的所有虫株都表现出均衡的抑制效果(IC₅₀值在8.8-51.5 nM之间)。

安全性评价

安全性是药物研发的关键考量因素。溶血实验显示，大多数候选化合物在50μM浓度下溶血率低于15%，表明对红细胞具有良好选择性。细胞毒性实验进一步证实，利福喷汀、甲氨蝶呤、ONX-0914和锑化合物对人胚胎肾293T细胞系的CC₅₀值大于100μM，而它们的抗疟IC₅₀值低于55 nM，选择性指数(SI)均大于100，显示出良好的安全窗口。

300μM. Among them,rifapentine,methotrexate,antimony,and ONX-0914 exhibited low cytotoxicity to HEK293T cells(CC50>100μM) and selective antiplasmodial activity against P. falciparum(IC50<55 nM), yielding SI values> 100.The data are shown as the mean±standard deviation from three independent assays. Error bars indicate the standard deviation(SD)'>

体内抗疟活性评估

体内实验是药物研发的关键环节。研究人员通过口服和腹腔注射两种给药方式，在柏氏疟原虫感染的小鼠模型中评估了优选化合物的治疗效果。

口服给药实验中，ONX-0914表现出最优异的疗效，在50 mg/kg剂量下达到95.93%的寄生虫抑制率，显著延长了感染小鼠的生存时间。甲氨蝶呤也表现出良好的口服效果，抑制率达到81.38%。WS3、利福喷汀和杜洛西汀的抑制率均超过65%。

对于口服生物利用度较低的化合物，研究人员进一步评估了其腹腔注射给药的疗效。ONX-0914、锑化合物和利福喷汀通过腹腔注射(20 mg/kg)均实现了100%的存活率，寄生虫抑制率超过90%。剂量效应关系研究表明，ONX-0914和锑化合物的EC₅₀值分别为6.52 mg/kg和10.02 mg/kg，显示出优异的体内抗疟活性。

临床症状和组织病理学改善

有效的抗疟治疗不仅体现在寄生虫抑制率上，还反映在临床症状和组织病理学的改善。与未治疗组相比，ONX-0914、甲氨蝶呤、锑化合物和利福喷汀治疗组的小鼠体重下降不明显(p<0.01)，疟疾相关症状如安静状态、竖毛和贫血等显著减轻。

器官病理学检查显示，治疗组小鼠的肝脾肿大明显改善。ONX-0914治疗组小鼠的肝脏和脾脏大小与未感染对照组相当(p<0.01)，且无肉眼可见的器官变色或损伤。组织学分析进一步证实，ONX-0914和氯喹治疗组小鼠的主要器官均未发现特异性病变，而锑化合物和甲氨蝶呤也显著减轻了疟原虫引起的器官损伤。

本研究成功建立了一套高效、系统的抗疟药物发现平台，将高通量筛选与多参数荟萃分析有机结合，显著提高了先导化合物发现的效率和成功率。该方法不仅适用于抗疟药物研发，也为其他传染病的药物发现提供了可借鉴的策略。

研究人员从9,547个化合物中最终优选出的三个最具潜力的候选药物——ONX-0914(蛋白酶体抑制剂)、甲氨蝶呤(叶酸代谢抑制剂)和锑化合物，均表现出对耐药疟原虫株的强效抑制活性和良好的安全性特征。特别是ONX-0914，无论是口服还是注射给药，在体内外实验中均表现出优异的抗疟效果，且能显著改善疟疾相关的病理变化，具有重要的开发价值。

这项研究的创新之处在于它打破了传统药物发现的线性流程，通过前期系统的多参数评估，有效降低了后期开发阶段的高失败风险，为抗疟药物研发提供了新的思路和方法学借鉴。随着耐药疟疾的持续蔓延，这种高效、经济的药物发现策略将为全球疟疾防控提供重要的工具支持。