儿童中枢神经系统疟疾恢复期凝血-纤溶系统与内皮功能持续失调的转录组学与生物标志物研究

《BMC Infectious Diseases》：Prolonged dysregulation of gene expression and biomarkers of coagulation, fibrinolysis, and endothelium in pediatric central nervous system malaria

本研究针对儿童中枢神经系统疟疾(CNS-M)恢复期分子机制不清的问题，通过纵向分析外周血单核细胞(PBMC)转录组和血浆生物标志物动态变化，发现CNS-M患儿在恢复6周后仍存在凝血/纤溶系统、血小板活化和内皮功能相关基因表达与生物标志物的持续失调，且与游离DNA(cfDNA)水平密切相关，为理解CNS-M远期神经认知后遗症提供了新视角。

　　

在疟疾肆虐的非洲地区，儿童是受影响最严重的群体。当感染恶性疟原虫后，部分患儿会发展为最凶险的中枢神经系统疟疾，即使经过青蒿琥酯等规范治疗，仍有约30%的幸存者会出现长期神经认知和行为障碍。这背后的分子机制究竟是什么？为什么有些孩子能完全康复，而另一些却要承受终身后遗症？这些问题一直困扰着医学界。

以往的研究多集中于比较急性期患儿与健康对照的差异，而对恢复过程中的动态变化知之甚少。美国凯斯西储大学和华盛顿大学的研究团队决心揭开这一黑箱，他们将目光投向了肯尼亚基苏木县的儿童医院，开展了一项历时四年的追踪研究。

为了全面解析CNS-M恢复期的分子特征，研究人员设计了严谨的队列研究，分别纳入37名CNS-M患儿、20名无并发症疟疾患儿和12名非疟疾发热患儿。他们在多个时间点采集血液样本：入院时（治疗前）、出院时（临床恢复后2-6天）、恢复后6周和6个月。样本经过精心处理，外周血单核细胞通过ficoll-hypaque密度梯度离心法分离并冷冻保存，血浆则用于多种生物标志物的检测。

技术方法上，本研究主要运用了RNA测序技术对外周血单核细胞进行全转录组分析，通过Reactome数据库进行通路富集分析，使用CIBERSORT算法估算免疫细胞亚群分布，并采用流式细胞术验证基础细胞类型频率。同时，通过酶联免疫吸附测定、多重MagPix检测和QUBIT测定等技术，系统评估了血浆中的疟原虫生物量、细胞游离DNA及多种与凝血、纤溶、中性粒细胞活化、内皮稳态和细胞因子信号相关的生物标志物水平。

研究结果

研究队列特征

Cohort

Central nervous system malaria (CNS-M;n=37)

Uncomplicated malaria (UM;n=20)

P-value CNS-M vs.UM

Acute febrile non-malaria(AFN; n=12)

P-value CNS-M VS. AFN

Median age(IQR) years

2.8(2.3-4.4)

5.25(4-8.7)

<0.001

5.5(4.2-7.7)

<0.001

Range

1.2-7.5

1.9-10

1.9-9.2

Number males(%)

23(62)

9(45)

NS

8(67)

NS

Median(IQR)axillary temperature C

39(38.05-39.5)

38.2(37.8-38.75)

0.013

37.8(37.7-38.5)

0.0024

CNS-M患儿年龄显著小于其他两组，体温和脉搏率更高，94.5%有全身性癫痫发作史，57%的患儿Blantyre昏迷评分<3。CNS-M组的中位HRP2水平是UM组的5倍，表明其寄生虫生物量更高。

PBMC转录组特征区分急性期CNS-M

转录组分析显示，CNS-M患儿入院时与出院时比较有740个基因上调，651个基因下调。上调基因富集于白细胞介素/细胞因子信号、中性粒细胞脱颗粒、先天免疫等通路；下调基因则主要涉及蛋白质生物合成。

恢复期Reactome通路变化揭示CNS-M特异性失调

从入院到恢复6周，CNS-M患儿表现出独特的通路动态变化。特别值得注意的是，与止血相关的Reactome通路在CNS-M恢复6周后特异性下调，而这一现象在UM和AFN患儿中未观察到。

四个关键基因特异性高表达于CNS-M

LAG3、CCR5、PDGFRB和ICMT这四个基因在CNS-M急性期特异性高表达，而在UM和AFN中未见类似现象，可能成为区分CNS-M与其他疟疾类型的潜在分子标志物。

血浆生物标志物验证转录组发现

生物标志物分析显示，CNS-M患儿在出院时和恢复6周后，多种与凝血/纤溶系统、中性粒细胞活化、内皮功能及细胞因子信号相关的生物标志物水平仍持续异常。

cfDNA与生物标志物的相关性提示持续血栓形成倾向

血浆cfDNA水平在CNS-M急性期显著高于UM和AFN，且在恢复6周后仍维持高位，而UM组则明显下降。相关性分析显示，cfDNA与多种血栓形成相关生物标志物存在显著关联。

研究结论与意义

本研究首次系统描绘了儿童CNS-M恢复期的分子动态图谱，揭示了凝血-纤溶系统、血小板活化和内皮功能的持续失调是CNS-M区别于UM的关键特征。这一发现具有重要的临床意义：

首先，研究确定了CNS-M恢复期特异性分子标志物，为早期识别高危患儿提供了潜在靶点。LAG3、CCR5、PDGFRB和ICMT等基因的特异性表达，以及止血通路的持续异常，可能成为预测神经认知后遗症的生物学指标。

其次，研究强调了cfDNA在CNS-M病理过程中的核心作用。cfDNA不仅与急性期严重程度相关，更与恢复期持续的血栓形成倾向密切相关，这为开发针对性的辅助治疗策略提供了新思路。类似于COVID-19和狼疮等炎症性血栓疾病中针对cfDNA的治疗方法，或许也可应用于CNS-M的临床管理。

第三，研究指出了恢复期监测的重要性。临床医生不应仅满足于急性期症状的缓解，而需要关注患儿出院后的分子水平恢复情况，特别是凝血和内皮功能状态的长期跟踪。

然而，研究也存在一些局限性。未能进行眼底镜检查区分视网膜病变阳性与阴性的CNS-M，样本量相对较小，AFN组的异质性较大，以及使用肝素而非柠檬酸盐作为抗凝剂限制了凝血功能分析等。这些局限为未来研究指明了方向。

展望未来，需要更大规模的队列研究来验证这些分子标志物的预测价值，同时结合神经认知评估，明确分子失调与临床后遗症之间的因果关系。单细胞转录组分析将有助于揭示特定细胞类型在恢复过程中的作用，而功能研究则能阐明cfDNA等分子在血栓形成中的具体机制。

这项发表于《BMC Infectious Diseases》的研究，不仅深化了对儿童CNS-M发病机制的理解，更重要的是为改善患儿长期预后提供了科学依据。在全球疟疾防控进入新阶段的今天，关注幸存者的生命质量与健康结局，具有格外重要的现实意义。