增强线粒体轴突运输促进神经肌肉接头形成：人类干细胞衍生神经肌肉组装体模型揭示Syntaphilin缺失的治疗潜力

《Molecular Medicine》：Syntaphilin loss enhances mitochondrial axonal transport and neuromuscular junction formation in a human stem cell derived neuromuscular assembloid model

本研究针对神经肌肉接头(NMJ)退行性病变这一神经肌肉疾病共性问题，利用人类干细胞衍生的3D神经肌肉组装体模型，首次证实通过CRISPR-Cas9敲除线粒体锚定蛋白Syntaphilin(SNPH)可增强运动神经元轴突线粒体运输能力，进而显著提升轴突密度和NMJ形成效率，为治疗年龄相关及ALS等疾病相关的NMJ功能障碍提供了新的靶点策略。

　　

当我们伸手拿起水杯，或迈步向前行走时，这一系列看似简单的动作背后，是神经与肌肉之间精密配合的成果。神经肌肉接头(NMJ)作为运动神经元与骨骼肌之间的关键连接点，如同电路中的开关，控制着肌肉的收缩。然而，这个重要的结构在健康衰老和多种神经肌肉疾病中却显得尤为脆弱。研究表明，NMJ退行性变是肌萎缩侧索硬化(ALS)等疾病的早期病理特征，但如何有效阻止这一过程仍是科学界面临的挑战。

线粒体作为细胞的能量工厂，在维持NMJ功能中扮演着核心角色。由于NMJ位于运动神经元的远端，需要大量能量支持其正常运作，因此线粒体的正常运输和分布对NMJ的维持至关重要。在ALS等疾病中，运动神经元内的线粒体运输受阻，导致NMJ能量供应不足，加速其退化过程。然而，增强线粒体运输是否能改善NMJ功能，这一问题尚未得到充分探索。

在这项发表于《Molecular Medicine》的研究中，Salzinger等人建立了一个创新的人类3D神经肌肉组装体模型，为研究NMJ提供了更接近人体真实情况的平台。研究人员通过融合人类干细胞衍生的脊髓类器官和原代骨骼肌类器官，成功构建出包含功能NMJ的组装体系统。为了探究增强线粒体运输对NMJ形成的影响，研究团队利用CRISPR-Cas9技术敲除了SNPH基因，该基因编码的蛋白负责将线粒体锚定在轴突微管上，抑制其运动。

研究采用的主要技术方法包括：人类干细胞培养与分化、3D神经肌肉组装体构建、CRISPR-Cas9基因编辑、免疫荧光染色与图像分析、线粒体活体成像、Western blot蛋白分析以及RNAscope原位杂交等技术。其中使用的原代骨骼肌细胞来源于商业供应商(Gibco)。

研究结果

人类干细胞衍生3D神经肌肉接头模型的建立与表征

研究人员成功建立了功能性神经肌肉组装体模型，该模型显示运动神经元轴突能有效投射到骨骼肌区域，并形成结构完整的NMJ。免疫荧光分析显示，神经丝重链(NFH)阳性的轴突与α-银环蛇毒素(BTX)标记的乙酰胆碱受体(AChR)形成共定位，表明预突触与后突触结构的成功对接。进一步研究发现，94%的NFH⁺/BTX⁺ NMJ与突触前标志物SV2A共定位，证实了这些结构的功能性突触特性。模型还表现出自发性肌肉收缩活动，且这种收缩可被AChR抑制剂筒箭毒碱阻断，进一步验证了NMJ的功能成熟度。

SNPH缺失增强运动神经元轴突中的线粒体运动性

通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑，研究人员成功构建了SNPH纯合敲除(SNPH^-/-)的人类干细胞系。在分化得到的运动神经元中，SNPH蛋白表达完全缺失，而线粒体蛋白VDAC1总量未受影响。活体成像分析显示，SNPH^-/-运动神经元中移动线粒体的比例显著增加，从野生型的15.7-22%提升至48.5-50.2%，证实了SNPH缺失可有效增强轴突中线粒体的运动能力。

SCO特异性SNPH功能缺失促进轴突密度和NMJ形成

在神经肌肉组装体中，脊髓类器官特异性SNPH缺失导致轴突密度随时间推移显著增加，特别是在D60时间点，SNPH^-/-组的NFH⁺轴突面积百分比从野生型的4%提升至6.1%。更重要的是，SNPH缺失显著影响NMJ的形成动态：D15时SNPH^-/-组的AChR支配率低于野生型(29.4% vs 40.7%)，但到D60时显著高于野生型(63.8% vs 40%)，表明SNPH缺失可能通过增强线粒体运输促进了NMJ的长期维持和形成。

讨论与结论

本研究通过建立人类3D神经肌肉组装体模型，为研究人类NMJ生物学提供了重要平台。该模型成功模拟了NMJ的关键特征，包括结构完整性、分子表达谱和功能性连接。特别值得注意的是，模型表达AChR聚类通路的关键基因，如CHRNA1、CHRNG和MUSK，尽管胚胎型γ-AChR亚基的表达占主导，这与人类NMJ在成年期同时表达胚胎型和成年型AChR的特点相符。

研究最重要的发现是，通过遗传手段减少SNPH表达可增强线粒体轴突运输，进而促进NMJ形成。这一效应可能是通过增加轴突末端能量供应或促进终端轴突分支实现的。在疾病背景下，尤其是ALS中常见的线粒体运输缺陷和NMJ退行性变情况下，增强线粒体运输可能成为有效的治疗策略。

该研究的局限性在于SNPH敲除是在干细胞阶段进行的，导致脊髓类器官中所有细胞类型均缺失SNPH。虽然SNPH主要在神经元中表达，且运动神经元选择性支配骨骼肌，但不能完全排除其他细胞类型的次级效应。

总之，这项概念验证研究表明，增强线粒体运动性可能为预防NMJ退行性变提供治疗靶点。未来的研究应进一步探索SNPH缺失在疾病背景下的作用机制，以及利用线粒体运输调节作为神经肌肉疾病治疗策略的潜力。