从开菲尔中分离的贝莱斯芽孢杆菌Bac-9通过产生多种活性代谢物增强番茄对烟粉虱及病原真菌的系统抗性

《BMC Microbiology》：Bacillus velezensis Bac-9, isolated from kefir, possesses antifungal activity and improves resistance of tomato plant against whitefly Bemisia tabaci

本研究针对农业病原真菌抗药性加剧及化学农药环境危害等问题，从墨西哥开菲尔中分离得到一株贝莱斯芽孢杆菌Bac-9。研究发现该菌株不仅能有效抑制镰刀菌、弯孢菌及疫霉菌等植物病原菌生长，其提取物还可激活番茄植株茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号通路相关防御基因表达，显著降低烟粉虱(Bemisia tabaci)的产卵量。全基因组分析揭示其含有21个次级代谢产物生物合成基因簇(BGCs)，包括非核糖体肽(NRPs)和聚酮化合物(PKs)，GC-MS检测到具有杀虫活性的噻丁环和苊烯等化合物。该研究为开发基于植物根际促生菌(PGPB)的生物防治产品提供了重要候选菌株。

　　

在当今农业生产中，病原真菌和害虫的肆虐给作物产量带来了巨大威胁。更令人担忧的是，随着化学农药的长期使用，病原菌的抗药性问题日益突出，同时农药残留对环境和人类健康造成的危害也引发了广泛关注。这种困境促使科学家们将目光转向了更加环保和可持续的解决方案——生物防治。在众多有益微生物中，芽孢杆菌属(Bacillus)细菌因其能够产生丰富的生物活性物质而备受青睐，它们不仅能直接抑制病原菌生长，还能激活植物自身的防御系统，形成一道天然的防护屏障。

与此同时，传统发酵食品开菲尔(kefir)作为一种含有多种微生物的共生体系，近年来被发现具有广泛的抗菌活性。这种富含乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的发酵乳制品，能否成为筛选新型生防菌株的宝库？这正是墨西哥研究团队在《BMC Microbiology》上发表的最新研究试图解答的问题。

研究人员从墨西哥埃斯卡尔塞加地区的开菲尔样品中分离得到一株编号为Bac-9的细菌菌株。通过系统的实验分析，他们发现这株细菌不仅对多种植物病原真菌具有显著抑制作用，还能激活番茄植株的防御机制，降低烟粉虱的为害。更为重要的是，基因组分析揭示了其丰富的次级代谢潜力，为理解其生防机制提供了分子基础。

为了全面评估Bac-9的生防潜力，研究团队采用了多种关键技术方法。他们通过对从墨西哥埃斯卡尔塞加地区开菲尔样品中分离的菌株进行16S rRNA基因测序和全基因组测序(使用Illumina NextSeq 500平台)，结合平均核苷酸一致性(ANI)分析进行物种鉴定。通过抗SMASH(antiSMASH)软件预测次级代谢产物生物合成基因簇(BGCs)，并利用RT-PCR技术检测非核糖体肽(NRPs)和防御相关基因的表达。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析细菌提取物中的活性化合物，并通过离体拮抗实验和温室生物测定评估菌株对病原真菌的抑制效果及对烟粉虱(Bemisia tabaci)的驱避作用。

Bac-9菌株抗真菌活性

研究发现，Bac-9菌株对三种植物病原真菌——茄病镰刀菌(Fusarium solani)、木贼镰刀菌(F. equiseti)和弯孢菌(Curvularia sp.)，以及一种卵菌——辣椒疫霉(Phytophthora capsici)均表现出显著的拮抗活性。在PDA平板的对峙培养实验中，Bac-9对测试菌株的径向抑制率在55%至83%之间，其中对辣椒疫霉的抑制效果最为显著，达到85%。

Bac-9菌株基因组测序、组装和注释

全基因组分析显示，Bac-9菌株的基因组大小为4,059,427 bp，包含4,195个编码序列，GC含量为46.3%。ANI分析表明该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)83菌株的相似性达99.32%，确认其分类地位。

次级代谢物生物合成簇预测

通过antiSMASH分析，在Bac-9基因组中鉴定出21个生物合成基因簇，其中55%为非核糖体肽(NRPs)，36%为聚酮化合物(PKs)，9%为NRP-PK杂合簇。这些基因簇编码包括丰原素(fengycin)、表面活性素(surfactin)、杆菌霉素(difficidin)、大环内酯(macrolactin)等多种已知具有抗菌活性的化合物。

NRPs的PCR检测与表达

通过特异性引物扩增和RT-PCR分析，证实了Bac-9菌株中iturin A、bacilysin和mycosubtilin等抗菌肽合成相关基因的存在及其在不同培养基中的表达。

番茄植株抗性基因的诱导

研究发现，用Bac-9菌悬液处理番茄植株后，防御相关基因ACC氧化酶(ACC oxidase)和PDF1.2的表达被特异性诱导，而NPR1基因在处理和对照组中均组成型表达。这表明Bac-9处理能够激活乙烯代谢和植物防御反应。

烟粉虱成虫在番茄植株上的驱避性

生物测定结果显示，Bac-9提取物对烟粉虱成虫具有驱避效果(驱避指数RI<1)，并能显著降低其产卵量(产卵驱避指数ODI为负值)。其中，10%乙酸乙酯提取物(M2)的效果最为显著。

气相色谱-质谱联用分析

GC-MS分析从Bac-9菌株提取物中鉴定出多种具有生物活性的化合物，包括具有杀虫作用的噻丁环(thietane)和苊烯(acenaphthylene)，具有杀菌活性的氟胞嘧啶(flucytosine)和联苯(biphenyl)，以及具有抗菌作用的苯甲酸(benzoic acid)、奎喔啉(quinoxaline)等。

研究结论与讨论部分强调，Bac-9菌株的生防能力源于其产生的多种次级代谢产物的协同作用。这些物质不仅直接抑制病原菌生长，还通过激活植物的系统抗性来增强其防御能力。全基因组分析揭示了其丰富的生物合成潜力，而基因表达研究则证实了关键抗菌肽合成基因的转录活性。特别值得注意的是，Bac-9提取物对烟粉虱的驱避和产卵抑制作用，扩展了其生防应用范围。

这项研究的意义在于发现了一株具有多重生防功能的贝莱斯芽孢杆菌菌株，为开发基于植物根际促生菌(PGPB)的复合生物防治产品提供了优质候选菌株。然而，研究者也指出，要将Bac-9成功应用于农业生产，还需要进行配方优化、规模化生产工艺开发和田间试验验证，以确保其在复杂环境条件下的防治效果和稳定性。这项工作为可持续农业提供了一种有前景的微生物资源，展示了微生物次级代谢产物在植物保护中的巨大潜力。