基于亲和力的蛋白质分析表明，HIGD1A 是马兜铃酸的直接靶蛋白

《Advanced Science》：Affinity-Based Protein Profiling Revealed that HIGD1A is a Direct Target Protein of Aristolochic Acids

通过设计AA亲和探针AA-P，结合化学蛋白质组学方法，在肾组织中鉴定出32个与AA直接结合的蛋白，其中HIGD1A以59.6 nm的高亲和力结合AA。研究证实AA通过破坏HIGD1A-TFAM复合体，导致TFAM降解和线粒体DNA泄漏，进而激活MAPK/NF-κB炎症通路。HIGD1A敲低加剧AA诱导的肾损伤，而过表达HIGD1A可缓解损伤，揭示HIGD1A-TFAM稳定是治疗AA肾毒性的新靶点。

　　本研究围绕着一种名为 aristolochic acid（AA）的化合物，其通过口服摄入含 AA 的药物或食物，对肾脏造成严重的毒性影响。尽管在过去几十年中，已有大量研究关注 AA 的毒性机制，但其直接作用的分子靶点仍未完全明确。研究团队通过设计并合成一种基于 AA 的亲和探针，构建了 AA 在小鼠肾脏组织中的结合蛋白图谱，从而揭示了 AA 的潜在作用靶点。研究发现，HIGD1A 是 AA 的一个高亲和力靶点，其与 AA 的结合会导致 TFAM（线粒体DNA的调控因子）的稳定性下降，并通过自噬-溶酶体途径触发 TFAM 的降解。这一过程导致细胞质中线粒体DNA的积累，进而激活 MAPK 和 NF-κB 通路，引发炎症反应。此外，AA 还通过破坏 HIGD1A 与 TFAM 的相互作用，影响线粒体功能，加剧肾脏损伤。这些发现不仅明确了 AA 的一个关键分子靶点，也为 AA 的毒性机制研究提供了新的思路，同时为开发相关治疗策略提供了潜在的靶点。

AA 是一种来源于中药植物（如 Asarum 和 Aristolochia）的硝基苯并菲羧酸类化合物，因其具有一定的药理活性而被用于治疗多种疾病，包括泌尿系统感染、肝炎、水肿和湿疹等。然而，20 世纪 90 年代，比利时出现了一种以快速进展性肾小管间质性肾炎为特征的罕见肾病，研究发现 AA 是导致该病的主要原因。随后，国际癌症研究机构（IARC）将 AA 分类为人类致癌物。AA 的毒性机制主要涉及其对 DNA 的亲电性加成反应，形成共价 DNA 加合物，从而引发基因毒性。此外，AA 会通过激活 NLRP3、PI3K/Akt 和 MEK/ERK 等信号通路，导致线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡。部分研究还指出，AA 的毒性与炎症反应和纤维化密切相关，这主要归因于 TGF 依赖和 JNK/MAPK 依赖的信号通路，以及 C3a 补体系统的激活。

然而，尽管过去三十年中对 AA 毒性机制的研究取得了一定进展，大多数研究仍然集中在 AA 引起的 DNA 加合物和一些经典炎症或氧化应激相关蛋白上。为了更全面地了解 AA 的毒性作用，研究团队采用了亲和蛋白组学（Affinity-Based Protein Profiling, A*f*BPP）的方法，这是一种在药物开发和化学生物学中广泛使用的靶点鉴定技术。该方法通过设计一种基于 AA 的亲和探针（AA-P），在小鼠肾脏组织中直接识别与 AA 结合的蛋白质。AA-P 的合成采用了光交联剂 diazirine 和生物正交反应位点 alkyne，使其能够与 AA 的结合蛋白形成共价键，并通过荧光标记或生物素连接进行进一步的检测。研究结果显示，AA-P 在细胞和小鼠体内均具有与 AA 相似的毒性，这表明其可作为有效的 AA 探针用于后续的蛋白组学分析。

利用 AA-P，研究团队在小鼠肾脏组织中成功鉴定了 32 个高可信度的 AA 结合蛋白，这些蛋白在功能上主要富集于线粒体、溶酶体和脂酶抑制活性。其中，HIGD1A 被鉴定为 AA 的高亲和力靶点。进一步的实验表明，AA 能够破坏 HIGD1A 与 TFAM 的相互作用，导致 TFAM 降解，进而引发细胞质中线粒体 DNA 的积累。这种线粒体 DNA 的异常释放可能通过激活 MAPK 和 NF-κB 通路，引发炎症反应。此外，研究还发现，HIGD1A 的过表达能够显著减轻 AA 引起的线粒体功能障碍和炎症反应，说明 HIGD1A 在 AA 毒性机制中具有关键作用。

为了进一步验证 HIGD1A 与 AA 的结合机制，研究团队采用了表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）等生物物理技术，分别测得其结合常数为 59.6 nM 和 195 nM，表明 HIGD1A 与 AA 之间存在高度特异的结合。此外，研究还通过 CETSA-WB 实验验证了 AA 对 HIGD1A 稳定性的影响，结果显示 AA 可显著增强 HIGD1A 的热稳定性。结合 LC-MS/MS 分析，研究团队进一步确定了 HIGD1A 与 AA 的结合位点，即 Val71-Tyr80 段，并通过分子对接模拟揭示了 AA 与 HIGD1A 结合的关键残基 Met72 和 Ala74。这些结果表明，AA 通过特异性结合 HIGD1A，破坏其与 TFAM 的相互作用，从而导致 TFAM 的降解和线粒体 DNA 的异常释放。

此外，研究还发现，HIGD1A 的敲低会加剧 AA 引起的线粒体功能障碍和炎症反应。通过 RNA-seq 和 RT-qPCR 技术，研究团队观察到 HIGD1A 敲低显著增加了与炎症相关的 mRNA 表达，如 ATF3、FOS、JUN、IL-6、TNF-α 和 IL-1β。同时，ELISA 实验也证实了 HIGD1A 敲低后这些炎症因子的表达水平显著升高。相反，HIGD1A 的过表达则显著抑制了 AA 引起的线粒体功能障碍和炎症反应。这说明 HIGD1A 在 AA 毒性机制中不仅具有保护作用，还可能在调控线粒体 DNA 释放和炎症反应中发挥关键作用。

为了进一步探索 AA 毒性机制，研究团队还进行了细胞毒性实验，观察了 AA 对 HK-2 细胞的毒性作用。结果显示，AA 能够显著降低 HK-2 细胞的存活率，并引发氧化应激、线粒体膜电位下降和 γ-H2A 的表达增加。同时，研究团队还通过 HIGD1A 敲低和过表达实验，进一步验证了其在 AA 毒性中的作用。敲低 HIGD1A 的 HK-2 细胞在 AA 处理后表现出更严重的线粒体损伤和炎症反应，而过表达 HIGD1A 的细胞则表现出更强的抗毒性能力。这些结果表明，HIGD1A 在 AA 毒性中具有重要作用，并可能作为调控 AA 毒性的重要靶点。

研究还探讨了 AA 毒性可能的分子机制。通过共免疫沉淀（Co-IP）和 LC-MS/MS 技术，研究团队发现 AA 能够破坏 HIGD1A 与 TFAM 的相互作用，导致 TFAM 的降解。这种 TFAM 的降解可能通过自噬-溶酶体途径进行，并最终引发细胞质中线粒体 DNA 的积累。这种线粒体 DNA 的异常释放可能通过激活 MAPK 和 NF-κB 通路，引发炎症反应。研究还发现，HIGD1A 的过表达能够逆转 AA 引起的线粒体 DNA 释放，从而减轻炎症反应。这些发现不仅揭示了 AA 毒性机制中的一个关键环节，也为开发针对 AA 毒性的治疗策略提供了新的思路。

此外，研究还指出，AA 的毒性不仅与线粒体损伤有关，还可能通过多种机制影响细胞功能。例如，AA 可能通过与 HIGD1A 的结合，影响线粒体膜电位和氧化应激水平，从而加剧细胞损伤。同时，AA 也可能通过破坏线粒体 DNA 的正常定位，引发细胞内的炎症反应。这些机制的发现有助于更全面地理解 AA 的毒性作用，并为相关疾病的治疗提供理论依据。

研究还强调了 AA 毒性研究的重要性。AA 作为中药中的常见成分，其毒性作用可能与传统中药的滥用有关。因此，深入研究 AA 的毒性机制，不仅有助于揭示其对肾脏的损害，也为中药的安全性评估提供了新的方向。此外，AA 的毒性机制研究可能对其他具有类似结构的化合物也具有借鉴意义。

尽管本研究取得了一定成果，但仍存在一些局限性。例如，目前的研究主要集中在 AA 与线粒体蛋白的相互作用，而其他重要蛋白如 NGAL、Bax 和 APOA1 等的作用尚未完全阐明。此外，AA 与 HIGD1A 的结合位点仍需进一步验证，以明确其具体的分子机制。同时，目前的研究主要在 HK-2 和 HEK293T 细胞中进行，未来还需在多种肾细胞类型中验证这些发现，以确保其广泛适用性。此外，由于缺乏 HIGD1A 敲低或过表达的小鼠模型，未来还需要通过动物实验进一步验证 HIGD1A 在 AA 毒性中的作用。

总之，本研究通过构建 AA 结合蛋白图谱，发现 HIGD1A 是 AA 的一个关键靶点，并揭示了其在 AA 毒性中的重要作用。这些发现不仅为 AA 毒性机制提供了新的见解，也为相关疾病的治疗和药物开发提供了潜在的靶点。同时，本研究还展示了 A*f*BPP 技术在识别小分子毒素靶点方面的应用潜力，为未来的毒理学和化学生物学研究提供了新的方法论支持。