在拥挤的水凝胶中，生物分子凝聚物的区室化与聚集现象有助于提升核酸诊断的效率

《Advanced Science》：Compartmentalization and Aggregation of Biomolecular Condensates in Crowded Hydrogels for Enhanced Nucleic Acid Diagnosis

紧凑水凝胶通过模拟细胞内无膜腔室环境，显著提升核酸扩增效率并降低检测限至0.51拷贝/μL，同时增强对高盐抑制剂的耐受性。该技术通过三维多孔水凝胶结构实现反应组分局域富集和空间分隔，有效促进引物-模板结合（增强1.37倍）及DNA聚合酶延伸活性（提升4.87倍）。实验证明，水凝胶介导的PCR可在26分钟内完成，较传统方法灵敏度提高两个数量级，并成功应用于复杂临床样本检测

　　在生物学领域，细胞内的复杂环境是许多关键生理功能实现的基础。细胞内部并非简单的均质溶液，而是一个高度拥挤的体系，其中各种生物分子如蛋白质、RNA等被组织成不同的功能区域。这种生物分子凝聚体，通常被称为膜状无膜结构的细胞器，能够通过液-液相分离机制自发形成，其作用在于提供物理隔离和分子交换的空间，同时通过高密度环境促进多种生化反应的高效进行。这种自然的细胞内环境不仅有助于隔离和集中反应物，还能支持多个反应同时进行且互不干扰，为细胞内复杂的代谢过程提供了重要支撑。

然而，尽管生物分子凝聚体在细胞内的功能已被广泛研究，但如何将这些特性应用到体外诊断技术中仍是一个挑战。传统的体外核酸检测方法通常依赖于稀释的溶液环境，这虽然便于操作，但也导致了酶反应速率缓慢、易受抑制物干扰以及检测灵敏度不足等问题。这些问题限制了疾病早期诊断和病原体快速筛查的效率，特别是在临床环境中，需要更快速、更灵敏的检测手段以提高诊断的准确性和时效性。

近年来，科学家们开始探索利用人工合成的材料模拟细胞内的拥挤环境，以提升体外诊断技术的性能。其中，水凝胶因其良好的生物相容性和可调节的多孔结构，成为一种有潜力的候选材料。水凝胶能够形成三维的微反应空间，这种空间不仅能够模拟细胞内的微环境，还能通过分子拥挤效应增强分子间的相互作用。例如，通过在水凝胶中引入特定的分子结构，可以促使核酸扩增反应的高效进行，从而提升检测的灵敏度和特异性。

在本研究中，我们提出了一种基于水凝胶的体外核酸诊断方法，旨在通过模拟细胞内的拥挤环境来提升PCR扩增效率。具体而言，通过将两种聚乙二醇（PEG）单体引入PCR反应体系中，利用其在碱性条件下的Michael加成反应，能够在短时间内形成三维多孔结构的水凝胶网络。这种水凝胶网络不仅能够将PCR反应成分聚集在纳米级的反应微环境中，还能够通过物理隔离减少分子间的相互干扰，从而提高反应的效率和特异性。

实验结果表明，水凝胶环境下的PCR扩增效率显著优于传统溶液环境。例如，在相同的模板浓度下，水凝胶中的循环阈值（Ct值）比溶液中的早了约4.34个循环，这说明水凝胶环境下的检测灵敏度提高了约20倍。此外，当模板长度增加时，传统溶液环境下的PCR扩增受到明显抑制，而水凝胶则能够保持较高的扩增效率。这表明水凝胶提供的纳米级反应微环境不仅能够增强分子间的相互作用，还能通过局部高浓度效应促进酶的活性。

值得注意的是，水凝胶环境对常见的PCR抑制剂如KCl具有较强的抵抗力。即使在高浓度的KCl存在下，水凝胶中的PCR扩增仍然能够维持较高的效率，而传统溶液中的扩增则受到显著抑制。这可能是因为水凝胶的拥挤环境有助于缓解K?对DNA聚合酶活性的抑制作用，类似于细胞内通过分子拥挤维持基因表达的机制。这种特性使得水凝胶环境下的PCR技术特别适用于复杂样本的检测，如临床样本和环境样本。

为了进一步验证水凝胶技术的实用性，我们还对其在不同样本类型中的表现进行了评估。结果显示，无论是在血液、尿液还是唾液样本中，水凝胶增强的PCR检测都能保持一致的性能，没有出现明显的Ct值延迟现象。相比之下，传统溶液环境下的PCR检测则在这些样本中表现出不同程度的抑制。这些结果表明，水凝胶增强的PCR技术不仅具有更高的灵敏度，还具备更强的抗干扰能力，能够在复杂的生物样本中实现准确的检测。

此外，我们还对水凝胶的物理和化学特性进行了系统分析。通过扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（ATR FT-IR）等技术，我们确认了水凝胶的多孔结构和功能基团的分布情况。水凝胶的高透光性也确保了其不会对光学检测造成干扰，这为在实际应用中进行实时荧光监测提供了便利。

为了深入理解水凝胶如何增强PCR效率，我们还设计了一系列实验，包括单链DNA（ssDNA）的延伸反应和荧光恢复实验。结果显示，水凝胶中的分子扩散速度明显低于溶液环境，这可能是因为水凝胶的拥挤结构限制了分子的自由移动。同时，通过荧光恢复实验，我们发现水凝胶能够显著提高分子间的结合效率，从而促进PCR反应的进行。

这些发现不仅揭示了水凝胶在模拟细胞内环境方面的潜力，还为体外核酸诊断技术的发展提供了新的思路。通过构建一个类似细胞内的微反应环境，水凝胶能够显著提升PCR扩增的效率，使检测灵敏度提高两个数量级。这一技术有望应用于病原体筛查、疾病诊断和基因测序等多个领域，为临床和实验室提供更快速、更灵敏的检测手段。

综上所述，本研究提出了一种基于水凝胶的体外核酸诊断方法，通过模拟细胞内的拥挤环境，显著提升了PCR扩增效率和检测灵敏度。该方法不仅能够有效应对传统溶液环境中的抑制因素，还能在复杂样本中保持良好的检测性能。这些成果为发展更先进的分子诊断技术提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。