在体声波设备中，免疫细胞浸润患者来源的胶质母细胞瘤细胞球体

《Lab on a Chip》：Immune cell infiltration of patient derived glioblastoma cell spheroids in acoustic levitation in bulk acoustic wave devices

患者来源胶质瘤细胞无支架三维结构构建及免疫细胞浸润研究。采用声流体动力学芯片，通过2MHz超声共振场实现细胞悬浮聚集，形成具有肿瘤微环境特征的球状体。优化芯片流体动力学控制，实现长期培养及多细胞类型递送。实验证明声悬浮系统可稳定维持胶质瘤细胞增殖（Ki67阳性率25%），并成功实现小胶质细胞HMC3向肿瘤球的定向浸润。该技术为胶质瘤生物学研究和免疫治疗开发提供了新型三维培养平台。

　　本研究介绍了一种基于声流体的设备，用于在无支架的环境中构建和培养由患者来源的胶质母细胞瘤细胞组成的多细胞肿瘤类器官（tumoroids）。这种设备能够支持肿瘤类器官的形成，无论是单独使用癌细胞还是结合非癌细胞进行共培养。通过优化设备的结构设计和声学参数，研究团队成功地在可控的环境中实现了肿瘤类器官的快速形成和长期培养，并且能够在声学悬浮状态下进行免疫细胞的渗透模拟，从而更真实地再现肿瘤微环境的复杂性。该方法为研究癌症生长和治疗反应提供了新的三维培养技术，有助于更深入地理解肿瘤与微环境之间的相互作用，以及开发更具针对性的免疫治疗策略。

### 胶质母细胞瘤与肿瘤微环境

胶质母细胞瘤是目前最常见且最具侵略性的恶性脑肿瘤之一，对现有治疗方法具有显著的抵抗性。通常的治疗方式包括手术切除、化疗和放疗的组合。然而，肿瘤的复杂性在于其高度的分子和细胞异质性，这种异质性源于不同的基因克隆、恶性细胞的极高可塑性，以及肿瘤侵袭的正常细胞成分。这些特性使得肿瘤对治疗产生耐药性，因此，为了更准确地模拟肿瘤的体内环境，建立合适的实验模型至关重要。

肿瘤微环境（TME）在促进肿瘤生长和侵袭性方面发挥了关键作用。它包括多种神经细胞（如星形胶质细胞、少突胶质细胞前体和神经元）和非神经细胞（如免疫细胞和血管成分），以及细胞外基质的成分。肿瘤细胞通过多种机制与TME相互作用，这些相互作用不仅影响肿瘤的发展，还决定了其对治疗的反应。例如，肿瘤细胞能够诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向促肿瘤状态转变，而肿瘤细胞与周围神经网络的相互作用则会形成有害的反馈循环，促进肿瘤生长并破坏神经活动。

为了更全面地理解这些复杂的相互作用，需要开发更精确的实验模型。传统的二维细胞培养虽然便于操作，但无法充分再现肿瘤的三维结构和细胞间相互作用。因此，三维细胞培养模型逐渐成为研究胶质母细胞瘤的重要工具。这些模型能够更好地模拟肿瘤的自然生长环境，保留其复杂的组织结构和细胞间相互作用，从而帮助研究者探讨肿瘤异质性、细胞侵袭和治疗耐药性的机制。

然而，大多数现有的三维模型依赖于支架材料，如各种含有或不含细胞外基质的水凝胶。尽管这些方法相对容易建立，但它们可能对细胞产生不确定的影响，且难以完全模拟肿瘤微环境。此外，一些新兴的器官芯片和细胞生物打印技术虽然能够引入肿瘤微环境的组成部分，但实施过程复杂，且生物打印对细胞造成一定应激。相比之下，声学悬浮技术提供了一种全新的细胞操控和培养方式，其优势在于无需使用支架，避免了物理接触带来的细胞应激，同时还能在三维环境中快速形成细胞聚集体，更接近体内的自然状态。

### 声学悬浮技术的优势

声学悬浮技术利用声波在共振腔中形成稳定的驻波，使悬浮在液体中的细胞被吸引到声压节点，并在此处聚集形成三维结构。这种技术能够实现细胞的非接触式操控，避免了传统细胞培养中常见的污染和细胞死亡问题。此外，声学悬浮还能促进细胞的自组织过程，使细胞在特定的时间内形成类肿瘤结构，并维持其活性和增殖能力。研究团队发现，使用声学悬浮技术培养的细胞，在10天内仍保持较高的存活率，甚至优于传统二维培养中的细胞。而且，细胞增殖速度更快，部分细胞如肝细胞能够更快地获得特定的功能，如分泌白蛋白。

声学悬浮技术还被广泛应用于细胞分选（声学分选）和高通量筛选，这使得它在细胞生物学和再生医学研究中具有广阔的应用前景。本研究中使用的声学流体芯片能够精确控制细胞的位置，从而便于观察细胞在动态环境中的行为和相互作用。然而，此前的研究主要集中在单一细胞类型的培养，而本研究则首次尝试在声学悬浮系统中引入第二种细胞类型，并评估其对肿瘤类器官形成的影响。

### 设备设计与优化

为了实现这一目标，研究团队设计了两种不同类型的声学流体芯片。一种是用于显微镜成像的单节点芯片，其尺寸为40 mm × 10 mm × 1.5 mm，能够在声学频率为2 MHz的情况下形成最多3个细胞聚集体。另一种是用于细胞培养的多节点芯片，尺寸为40 mm × 8 mm × 5 mm，可容纳多达14个细胞聚集体，内部体积为1 mL。这两种芯片的结构设计均考虑了声学约束和流体控制，以确保在声学悬浮过程中保持细胞的稳定性和培养环境的可控性。

在制造过程中，研究团队使用了PDMS（聚二甲基硅氧烷）和玻璃材料，通过激光切割和粘合工艺制作了微流控芯片。PDMS具有良好的生物相容性和气体渗透性，使得细胞能够在芯片内部进行气体交换，维持其生理功能。此外，芯片的密封设计也有效防止了培养基的蒸发，同时避免了气泡的形成，为细胞提供了更加稳定的培养环境。

为了确保声学悬浮的稳定性，研究团队在芯片中引入了橄榄油作为声学耦合介质，以提高声波在PDMS和玻璃之间的传递效率。同时，他们还优化了声学参数，包括频率和电压，以实现最佳的细胞捕获和聚集效果。实验结果显示，使用5 V的电压能够有效地维持细胞在声压节点的稳定悬浮，而不会在转移过程中造成细胞的损失。

### 肿瘤类器官的形成与长期培养

在声学悬浮环境中，胶质母细胞瘤细胞能够在短时间内形成稳定的细胞层，并进一步自组织为三维肿瘤类器官。通过显微镜成像，研究团队观察到细胞在悬浮状态下逐渐聚集，形成类似于肿瘤组织的结构。此外，他们还评估了肿瘤类器官在长期培养中的存活率和增殖能力。结果表明，声学悬浮并未影响细胞的活性，且在培养6-7天后，仍然能够保持超过95%的细胞存活率。

在细胞组织学分析中，研究团队使用了DAPI染色和EGFR免疫染色，以评估细胞的排列方式和增殖状态。结果显示，细胞在肿瘤类器官中保持紧密的接触，且EGFR的表达表明细胞间存在功能性相互作用。此外，Ki67免疫染色进一步证明了肿瘤类器官内部的细胞增殖活性，表明声学悬浮技术能够有效维持细胞的生长状态。

### 免疫细胞的渗透与相互作用

为了更全面地模拟肿瘤微环境，研究团队还探索了声学悬浮技术在引入免疫细胞方面的潜力。他们使用了HMC3微胶质细胞系，通过细胞追踪染料标记，观察其在声学悬浮中的行为。实验结果表明，微胶质细胞能够被成功引入肿瘤类器官中，并在三维环境中形成特定的渗透模式。通过组织清除和共聚焦成像，研究团队进一步确认了微胶质细胞在肿瘤类器官内部的分布情况，表明声学悬浮技术能够有效模拟免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。

此外，研究团队还尝试通过分步注射不同类型的细胞来构建多层肿瘤类器官。他们首先注射了蓝色标记的聚苯乙烯微球，随后注射了红色标记的微胶质细胞。结果显示，微胶质细胞能够围绕先前形成的聚集体进行渗透，最终形成同心结构的肿瘤类器官。这一过程展示了声学悬浮技术在构建复杂细胞结构方面的潜力，为研究肿瘤与免疫细胞之间的动态相互作用提供了新的实验平台。

### 技术应用与未来展望

本研究的成果表明，声学悬浮技术不仅能够用于构建和培养肿瘤类器官，还能够模拟肿瘤微环境中的复杂细胞相互作用。这种技术为研究肿瘤的生物学特性、治疗反应以及免疫细胞的渗透行为提供了更加真实和可控的实验模型。相比于传统的二维培养，声学悬浮技术能够在不依赖支架的情况下实现细胞的自组织，从而更好地再现肿瘤的自然结构和功能。

此外，该技术的可扩展性和兼容性也使其成为开发新型治疗方法的重要工具。由于声学悬浮能够实现细胞的精确操控，因此可以用于高通量筛选，评估不同药物对肿瘤类器官的影响。同时，该技术还支持实时成像，使得研究人员能够观察细胞在三维环境中的动态行为，包括增殖、迁移和相互作用。

声学悬浮技术的另一个重要优势是其对细胞行为的非侵入性。由于细胞在悬浮状态下无需接触任何基质，因此能够更真实地反映其在体内的状态。这种特性使得声学悬浮技术成为研究肿瘤生物学和免疫学的有力工具，为开发更有效的免疫治疗策略提供了新的思路。

综上所述，声学悬浮技术为构建和研究肿瘤类器官提供了一种创新的方法。通过精确控制声学环境和流体动力学条件，该技术能够在无支架的环境中实现细胞的自组织和长期培养，同时支持免疫细胞的渗透。这些发现不仅推动了对肿瘤微环境复杂性的理解，还为未来的癌症治疗研究提供了新的实验平台。