两种加勒比珊瑚物种对热变预处理反应的分子差异

《Ecology and Evolution》：Differences in Molecular Responses to a Thermally Variable Preconditioning Treatment for Two Caribbean Coral Species

温度波动预处理对两种加勒比海珊瑚的热适应影响及分子机制研究。摘要：通过基因表达分析发现，温度波动预处理显著改变了刺尾珊瑚（Acropora cervicornis）的宿主和共生藻基因表达模式，抑制热应激反应相关基因（如过氧化酶、一氧化氮合成酶），上调表观遗传调控基因（如组蛋白H2A），并增强其热应力后的光合效率。而脑珊瑚（Pseudodiploria clivosa）响应较弱。研究揭示了物种特异性热适应机制，为珊瑚礁恢复提供了分子依据。

　　海洋变暖是全球珊瑚礁面临的主要威胁之一，它导致了珊瑚白化事件的频率增加。然而，一些生活在温度变化较大的环境中的珊瑚展现出对热应激的适应能力。因此，应用温度变化进行辅助适应已被认为是珊瑚修复工作中的一个有前景的干预措施。尽管先前的研究支持这种技术用于热预适应，但其背后的分子机制仍不清楚。为了解决这一研究空白，本研究对两种加勒比海珊瑚物种——鹿角珊瑚（*Acropora cervicornis*）和有棘脑珊瑚（*Pseudodiploria clivosa*）进行了温度变化处理，并评估了宿主和共生藻类（属于Symbiodiniaceae家族）基因表达的变化。总体来看，宿主和共生体对适应性处理的反应是物种特异性的。在鹿角珊瑚中，温度处理导致了更多关键应激反应基因的转录变化，包括过氧化物酶、一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子基因的显著下调，以及与组蛋白修饰相关的基因的上调。这些基因此前已被认为是珊瑚普遍应激反应的一部分，这表明热预适应的分子机制可能涉及相似的途径。考虑到本研究中观察到的物种间反应差异，为了在修复工作中大规模应用这一方法，还需要在更广泛的珊瑚礁建造物种中进行进一步研究。

随着海洋温度的升高，珊瑚的生存状况正受到越来越大的威胁，导致了频繁的白化事件。这种现象对珊瑚礁生态系统的稳定性造成了严重的影响，因此理解珊瑚的热耐受性和应激恢复能力对于生态系统保护至关重要。在佛罗里达州，增强珊瑚耐热性的主动干预措施是优先事项，包括选择性繁殖、辅助基因流动、宿主-共生体社区调控以及预适应等方法。预适应通过暴露于亚致死水平的应激源，可以诱导珊瑚幼虫和成体更耐热的表型，这在珊瑚修复项目中尤为重要，因为其潜在的益处可以传递给未来的后代。尽管减少人为碳排放是确保珊瑚礁生态系统持续存在的必要措施，但科学家和海洋管理者也必须研究本地方法，以延缓海洋变暖对珊瑚的影响。

当前的文献支持在受控实验室实验中使用热预适应来提高珊瑚的热耐受性。然而，大多数研究采用的是静态温度处理，这不太可能代表珊瑚礁的自然条件。温度变化也可能成为热预适应的一种途径，因为生活在自然温度变化较大的环境中珊瑚通常表现出更强的热耐受性，并且在海洋热浪期间出现较少的白化现象。一些实验室研究已经证实了这一点，这些研究主要集中在太平洋珊瑚物种以及共生藻类的光合反应上。尽管基因表达分析已被用于研究热预适应，但这些分析尚未在加勒比海珊瑚的背景下应用，这将为该过程提供关键的见解。

由于对珊瑚白化反应的分子机制仍存在许多知识空白，通过遗传学视角研究热预适应是理解珊瑚耐受性和适应性的关键途径。现有的文献已经突出了一些在热应激暴露后通常被激活的关键基因，包括热休克蛋白（HSPs）、肿瘤坏死因子（TNF）受体等，以及与细胞死亡信号、先天免疫反应和氧化应激反应相关的基因。然而，热应激的持续时间决定了转录反应的强度，短期处理会导致基因表达的减少，而长期暴露则与应激反应基因的基线表达水平升高有关，这种现象也被称为“基因前置”（gene front-loading）。此外，一项对转录组数据集的元分析发现，*Acropora*属珊瑚在应用不同水平的热应激时表现出两种不同的基因表达模式：一种与各种应激源的高水平相关，且在实验之间有较强的关联性；另一种则与低水平的应激相关，并且在实验之间表现出更大的变异。这些研究表明，需要进一步研究以确定在热预适应过程中珊瑚宿主和共生体所使用的遗传途径。

在加勒比海珊瑚中，温度变化用于热预适应的分子机制仍处于研究的初级阶段，尤其是对于修复优先物种。为了解决这些空白，本研究对两种具有不同生命周期策略和共生藻类群落关联的加勒比海珊瑚物种进行了28天的温度变化处理，以提高其热耐受性。随后，我们测量了处理前后珊瑚宿主和共生体的基因表达模式变化，以识别每个物种所采用的分子机制。为了评估温度变化处理对珊瑚热耐受性的影响，我们使用了一种快速热应激实验，在处理结束后立即进行。评估的物种包括*Acropora cervicornis*和*Pseudodiploria clivosa*，这两种珊瑚在佛罗里达州被广泛繁殖和移栽以促进珊瑚礁的修复，因此研究它们的适应机制对于提高辅助适应的有效性至关重要。

为了评估温度变化处理对珊瑚宿主和共生藻类基因表达的影响，我们从随机选择的珊瑚碎片中获取了小组织样本，这些样本在处理开始前和结束后立即保存在DNA/RNA Shield中，并在-80°C下冷冻直到处理。为了避免重复采样的潜在干扰，不同时间点的珊瑚碎片是分别采样的。每个物种、每个菌落和每个处理组共采集了4个碎片，总共48个样本。为了确保时间点的一致性，珊瑚是在处理期间和控制组温度达到28°C时进行采样的。

总RNA提取采用了DNA/RNA Biomics Miniprep提取协议，包括可选的HRC抑制剂去除步骤和RNA Clean and Concentrator-5试剂盒。所有样本均被标准化为10 ng/μL，并送往德克萨斯大学奥斯汀分校的基因组测序与分析设施进行文库制备和测序。我们采用了Tag-Seq文库制备方法，并将文库混合后在Illumina NovaSeq S2 SR100上进行测序。原始序列通过自定义的Perl脚本进行处理，这些脚本去除了重复序列并进行了适配体修剪，然后使用cutadapt v4.4工具以15的修剪阈值进行质量过滤。序列随后通过Bowtie2 v2.5.2工具映射到相应的宿主基因组或转录组以及一个包含Symbiodiniaceae 28S序列的参考数据库中。同时，序列还映射到*Acropora*属的基因组和转录组，以及*Symbiodinium* spp.、*Durusdinium* spp.、*Breviolum* spp.和*Cladocopium* spp.的参考数据库。对同时映射到宿主和共生体基因组或转录组的序列进行了剔除。

对于*Acropora cervicornis*，所有样本都与*Symbiodinium* spp.完全匹配，而*Pseudodiploria clivosa*的样本则有98.9%与*Breviolum* spp.匹配。因此，我们分别将共生体基因组与宿主基因组或转录组连接，用于参考比对。使用SAMtools v1.3程序对基因计数进行了量化。此外，我们使用GitHub上的“annotatingTranscriptomes”和“emapper_to_GOMWU_KOGMWU”协议创建了宿主和共生体的基因组和转录组注释，这些协议使用*eggnog-Mapper*工具基于共识同源基因生成预测的基因名称，并匹配基因本体（GO）和真核生物同源群（KOG）功能。

在处理后，所有样本的平均读数（±标准误）分别为*Acropora cervicornis*的11.8 ± 0.4百万读数和*Pseudodiploria clivosa*的9.8 ± 1.0百万读数。经过修剪后，这些数值分别降至*Acropora cervicornis*的3.6 ± 0.2百万读数和*Pseudodiploria clivosa*的0.7 ± 0.08百万读数。对于*Acropora cervicornis*，比对率为61% ± 0.6%，这导致了30,122个宿主基因和43,816个共生体基因的覆盖。对于*Pseudodiploria clivosa*，比对率为91.7% ± 0.2%，覆盖了59,947个宿主基因和26,253个共生体基因。不同物种之间的差异可能源于RNA提取产量、样本质量和参考基因组/转录组质量的不同。每个样本的计数和比对率可在本研究的GitHub存储库中找到。

为了评估不同处理组之间的基因表达差异，我们使用了*DESeq2* R包对两个物种的读数进行分析。每个物种的宿主和共生体的差异基因表达分析是分别进行的。*Symbiodinium*的分析仅包括来自*Acropora cervicornis*的样本，而*Breviolum*的分析仅包括来自*Pseudodiploria clivosa*的样本。我们去除了在所有样本中计数小于10的基因，并构建了*DESeq2*模型，设计为“~Colony + Treatment”。数据随后通过方差稳定变换进行转换。使用*arrayQualityMetrics* R包对转换后的数据进行了离群值检测，并根据默认的样本数组距离标准去除了离群值。

为了考虑在处理开始前收集的样本与处理结束后的样本之间的差异，我们分别将样本分为三个组：初始（Day 0）、对照（Day 28）和变化（Day 28）。随后，使用方差稳定变换对*DESeq2*模型进行了转换，并通过主坐标分析（PCoA）进行了可视化，应用曼哈顿距离。接下来，我们使用PERMANOVA对由主坐标确定的曼哈顿距离进行了分析，以测试菌落和处理作为固定效应的显著性，采用1e6次排列和来自*vegan* R包的“adonis2()”函数。在三个处理对比中，我们分别使用Wald检验确定了显著上调和下调的基因数量，显著差异表达基因（DEGs）定义为调整后的假发现率（FDR）p-值（p-adj）截断值为0.05，以及对数2倍变化（L2FC）截断值为1（上调）和-1（下调）。使用*ggvenn* R包生成了三种处理对比之间的共同和独特DEGs的韦恩图。

为了评估基因功能组是否在每个处理对比中富集，我们进行了基因本体（GO）富集分析，使用Mann-Whitney U检验在R包*GO_MWU*中进行。每个*DESeq2*对比独立进行分析：“对照 vs. 初始”、“变化 vs. 初始”和“变化 vs. 对照”。GO富集项被组织成三个类别以解释基因组的功能：生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）。对于每个对比的基于排名的富集分析，GO项被过滤以包含至少五个基因且少于10%的总基因数，并将聚类合并阈值设为0.25。所有功能富集分析均在所有表达基因上进行，以调整后的假发现率（FDR）p-值为显著性测试的alpha水平0.05。为了便于可视化，我们使用R包*ggplot2*生成了每个类别（BP、MF、CC）的前五项显著GO项的气泡图，这些GO项是通过“变化 vs. 对照”和“变化 vs. 初始”对比中基于L2FC的富集分析得出的，并首先去除了“对照 vs. 初始”对比中的显著GO项。

一项关于*Acropora*属的转录组元分析发现，珊瑚经历的热应激严重程度影响了基因表达的结果，并将基因表达分为两种不同的环境应激反应（ESR）类型：一种是高应激水平下的“类型A”反应，其基因表达模式在实验之间具有强相关性；另一种是低应激水平下的“类型B”反应，其基因表达模式在实验之间表现出更大的变异。元分析生成了基于*DESeq2*得出的对数转换p-值（lpv）排名的GO BP项。随后，研究者应用了“类型A”和“类型B”ESR对比以评估热挑战后的遗传结果是否与2020年的元分析结果一致。根据这一方法，本研究的GO BP项在“变化 vs. 对照”对比中被用来计算与*Acropora*元分析的基于排名的相关性。目标是评估本研究中*Acropora cervicornis*的温度变化处理是否与“类型A”或“类型B”ESR相关。GO-MWU富集分析提供了每个GO项的delta排名，这是一个实验数据集内的相对值，用于比较与特定GO项相关的基因组在处理和对照样本之间的表达情况。本研究的GO BP项与*Acropora*元分析中共享的GO项被绘制在相关图上，并根据元分析将“类型A”和“类型B”GO项分开。本研究与元分析之间共享的GO BP项被编码为热图，并绘制了最佳拟合线以展示与“类型A”或“类型B”ESR的正相关或负相关。

在本研究中，我们发现热应激反应背后的相同机制也适用于预适应，但差异表达基因的方向与之前的研究结果不同，尤其是关于“基因前置”作为适应机制的假设。当前文献中记录的acroporids的转录反应可能由于应用的热应激水平和持续时间不同而存在矛盾。例如，Bay和Palumbi的研究发现，在处理后，稳定温度与变化温度处理的*Acropora nana*之间没有显著的基因表达差异，但在热应激后，变化温度适应的珊瑚表现出基因表达水平的降低。这与长期变化温度适应的*Acropora hyacinthus*研究结果不同，后者在一年内观察到基线表达的变化。因此，对不同珊瑚物种应用短期和长期的变化温度处理对于提高热预适应的有效性至关重要，正如最近的研究所证明的那样。

尽管GO分析无法在*Pseudodiploria clivosa*的数据集上进行，因为差异表达基因的数量较少，但该珊瑚宿主的基因注释也支持了应激反应的抑制，因为其HSP和蛋白质折叠活性出现了显著的下调。之前对*Pseudodiploria clivosa*施加短期热应激的研究发现，HSPs、胶原蛋白和TNF受体相关因子表现出上调模式，这表明本研究中应用的变化温度处理并未激活*Pseudodiploria clivosa*的热应激反应。*Breviolum* spp.的缺乏差异表达基因也支持了其共生体在变化温度处理后未表现出应激反应。

在本研究中，差异表达基因的表达模式表明，组蛋白基因和与表观遗传调控相关的GO项可能在长期适应中通过表观遗传修饰发挥调节作用。表观遗传修饰影响基因的可及性，并被认为在预适应中起作用，因为表观遗传变化可以由环境驱动，并且可以在珊瑚的不同世代中遗传。此外，组蛋白的转录可塑性可能解释了为什么在多次热应激事件后会出现表型益处。在本研究中，变化温度处理的*Acropora cervicornis*组蛋白H2A基因表现出显著的上调。经典的组蛋白2A参与DNA的紧密包装成核小体，从而影响基因表达的可及性。组蛋白H2A.X的后翻译磷酸化，该组蛋白与DNA损伤反应相关，已被与*Acropora cervicornis*的营养和热应激联系起来。然而，本研究中不同处理组的H2A.X基因表达没有显著差异，这与一项关于东部牡蛎毒素暴露的研究结果一致，但与一项关于淡水水母*Hydra*的研究结果相矛盾。这种基因表达的不一致可能再次归因于采样时间，并且需要进一步的研究来理解环境变化后珊瑚中表观遗传调控的分子机制。

尽管组蛋白H2A的上调可能是变化温度预适应的一个潜在机制，但变化温度处理的*Acropora cervicornis*中与表观遗传调控相关的多个GO项却表现出下调趋势。先前的研究表明，DNA甲基化通过调控基因表达影响珊瑚的表型适应。然而，本研究中观察到的差异表达模式可能通过DNA-组蛋白相互作用的稳定性，激活或抑制基因表达，从而打开或阻碍基因组区域的可及性。未来的变化温度预适应研究应结合DNA和组蛋白修饰的分析，以确定本研究中观察到的基因表达模式是否在表观遗传层面上发生改变。

总体而言，本研究通过新型地描述*Acropora cervicornis*和*Pseudodiploria clivosa*宿主和共生体基因表达反应，为热预适应领域做出了贡献。在*Acropora cervicornis*中，3°C的每日温度波动导致了更显著的基因调控和应激反应（ESR）的减弱，这可能表明了适应或由于环境变化而重新分配能量支出。然而，温度变化对共生藻类的光合生理影响却存在差异，其中变化温度处理的*Acropora cervicornis*表现出更高的光合效率，而变化温度处理对*Pseudodiploria clivosa*的光合性能没有显著影响。这可能是因为施加的剂量不足以观察到*Pseudodiploria clivosa*的表型变化，而*Pseudodiploria clivosa*是一种已知的耐热物种。未来的研究应在此基础上进行，通过调查不同持续时间和剂量的温度变化，以及更多珊瑚礁建造物种的基因表达数据，以生成更全面的元分析，从而提高对适应机制的当前理解。