迈向移动化：利用便携式基因组技术实现无需PCR的现场物种鉴定及实时分子系统学分析

《Ecology and Evolution》：Going Mobile: Using Portable Genomic Technologies for PCR-Free In Situ Species Identification and Real-Time Molecular Systematics

便携实验室结合靶向长读纳米孔测序可现场进行多物种基因组与系统发育分析，有效提升无扩增环境下的分子物种鉴定效率。

　　随着人类活动对环境的持续影响，全球范围内的动物多样性正面临前所未有的威胁。这些变化不仅影响了动物的分布范围，还可能促进病原体的传播，尤其是那些通过媒介传播的病原体和跨物种传播的病原体。为了应对这些挑战，准确且及时的生物多样性评估以及分子物种监测显得尤为重要。本文探讨了一种结合便携式实验室与长读长纳米孔测序技术的方法，以实现现场的基因组学和系统学分析，适用于多种动物分类群。研究在南美洲圭亚那的两个生态差异显著的野外地点进行，采集了小型哺乳动物和吸血昆虫样本，包括蝙蝠、啮齿类动物、有袋类动物、蚊子和沙蝇等。每个样本的基因组DNA在野外提取后，用于制备纳米孔测序文库。

为了提高现场测序的效率和准确性，研究团队采用了一种新型的基于软件的靶向测序方法——纳米孔自适应采样（NAS）。该方法通过使用与相关物种的线粒体基因组组装作为富集目标，实现了对线粒体读数的选择性测序。通过现场测序实验得到的碱基调用数据，被用于组装完整的线粒体基因组，并生成线粒体生物标记基因的共识序列。为了进一步确认分子鉴定结果，研究团队结合了本地核酸碱基序列BLAST查询和最大似然分析，利用这些共识序列进行分析。这种方法避免了传统的基于聚合酶链式反应（PCR）的繁琐步骤，从而简化了文库制备、测序实验和现场分析的流程。

研究发现，NAS方法在便携式实验室中具有显著的优势。这种方法不依赖于PCR扩增，使得现场测序能够快速、高效地完成。在圭亚那的两个野外地点，研究人员利用NAS方法成功地进行了线粒体基因组的靶向测序，从而获得了丰富的长读长数据。这些数据不仅用于线粒体基因组的组装，还用于生成生物标记基因的共识序列，为后续的系统学分析提供了基础。通过NAS方法，研究团队能够在不依赖复杂实验室设备和条件的情况下，完成对多种动物样本的分子识别，这对于那些缺乏实验室基础设施的热带地区尤其重要。

在野外采集过程中，研究团队采用了一系列优化的采样策略，以确保样本的质量和多样性。在Mahaica和Kwebana两个地点，他们分别使用了不同的采样工具和方法，包括使用雾网捕捉蝙蝠，以及在房屋周围和潜在的吸血昆虫栖息地放置光陷阱。这些方法使得研究人员能够收集到不同分类群的样本，包括蝙蝠、啮齿类动物和有袋类动物等。此外，吸血昆虫的样本则通过手动吸管采集，并根据其形态特征进行初步分类。

在野外实验室的设置方面，研究团队采用了多种优化的设备和方法，以确保实验的顺利进行。为了减少样本污染的风险，他们使用了一个小型的“弹出式”帐篷，其内侧和外侧表面定期用70%乙醇进行消毒。DNA提取和纳米孔测序文库制备均在便携式实验室中完成，使用了专门的仪器和试剂，如DNA提取试剂盒、纳米孔测序试剂盒和适配器连接套件。为了确保测序过程的稳定性和可靠性，研究团队还使用了太阳能电池和补充电池包为小型设备供电，如微型离心机和恒温块。

在数据处理和分析方面，研究团队采用了一系列优化的生物信息学方法。首先，他们对每个样本的碱基调用数据进行了质量过滤和长度筛选，以去除低质量读数和过短或过长的非目标读数。然后，他们将过滤后的读数与线粒体基因组参考数据库进行比对，以提取线粒体DNA读数。通过这种方法，研究团队成功地组装了多个样本的线粒体基因组，并生成了生物标记基因的共识序列。这些共识序列被用于构建多序列比对，并进一步进行系统学分析，如最大似然树的构建和遗传距离的计算。

研究结果显示，NAS方法在便携式实验室中的应用取得了显著的成功。通过该方法，研究团队能够在短时间内完成对多种动物样本的分子识别，包括蝙蝠、啮齿类动物和吸血昆虫。例如，在Mahaica地点，研究人员成功识别了六种蝙蝠，其中两种被鉴定为特定物种，而另外四种则被确认为近缘种。在Kwebana地点，研究人员则成功识别了四种蝙蝠，其中一种被确认为特定物种，其他三种则被归为近缘种。此外，对于一些无法通过形态学特征明确识别的样本，如蚊子和沙蝇，研究团队通过NAS方法和后续的分子分析，成功地进行了物种鉴定。

尽管NAS方法在便携式实验室中展现出显著的优势，但研究团队也遇到了一些挑战。例如，某些样本的测序输出低于预期，这可能与文库制备过程中使用的连接酶效率有关。在野外环境中，由于设备的限制和环境条件的不确定性，某些步骤的效率可能受到影响。此外，部分样本的线粒体基因组组装未能成功，这可能与非线粒体DNA片段（如核线粒体片段）的意外富集有关。这些挑战表明，尽管NAS方法在实际应用中具有巨大潜力，但仍需进一步优化和改进，以确保其在不同环境和样本条件下的可靠性。

总的来说，本文展示了一种结合便携式实验室和NAS方法的新技术，能够有效提高现场生物多样性监测和分子物种识别的效率。这种方法不仅减少了对传统PCR技术的依赖，还能够在野外环境中快速生成高质量的分子数据，为病原体的监测和防控提供了重要的支持。随着分子生物学技术的不断进步，便携式实验室和NAS方法的应用前景广阔，有望成为未来生物多样性研究和病原体监测的重要工具。