通过对Guerrero Negro高盐微生物垫进行基因组解析，揭示了该分层群落中关键微生物的代谢潜力

《Environmental Microbiology》：Genome-Resolved Approach of Guerrero Negro Hypersaline Microbial Mats Reveals the Metabolic Potential of Key Players in a Stratified Community

微生物膜生态学 摘要：本研究通过基因组组装（MAGs）分析墨西哥Guerrero Negro盐田的高盐微生物膜，比较了环境样本与添加H2/CO2、TMA等底物的微宇宙培养样本。共获得170个高质量MAGs，涵盖25个细菌门和4个古菌门，揭示表层依赖光合作用（CBB、3HP），下层以硫酸还原和甲烷生成为主。垂直分布显示，古菌MAGs（如Methanosarcinaceae）在添加TMA时显著富集，而细菌如Chloroflexota和Bacteroidota在不同层次具有动态代谢适应。首次基因组分析证实该膜社区存在光能自养与厌氧异养代谢的垂直分层，并关联了硫循环与碳固定代谢的时空分布。

　　### 生物膜在加利福尼亚湾的生态与代谢特征解析

在加利福尼亚湾的Guerrero Negro地区，存在一种高度多样化的嗜盐微生物生物膜，其内部代谢活动具有明显的昼夜变化。这些生物膜在结构上呈现出明显的分层特征，其中氧气的光合作用和硫酸盐还原是主要的细菌代谢过程，而甲基营养型甲烷生成则是主要的古菌代谢路径。尽管这些代谢过程在生化层面已被广泛研究，但关于这些微生物的种类及其编码的代谢途径，目前主要依赖基因标记数据进行推测。本研究通过环境样本和实验暗处理样本（包括对照组、H?/CO?组、TMA组和H?/CO?-TMA组）的基因组解析方法，探索了较少了解的厌氧策略，确定了主要微生物玩家的代谢潜力，并对整个生物膜社区进行了分析。通过获得170个代表性的宏基因组拼接基因组（MAGs），涵盖了25个细菌门和4个古菌门。这些MAGs的代谢分析表明，在环境样本中，光合微生物是有机质的主要来源，而不同硫化物作为电子受体则促进了生物膜下层部分降解有机质的代谢过程。这些发现将生物化学过程与微生物玩家联系起来，为Guerrero Negro生物膜的生态理解提供了新的基因组视角。

#### 研究背景

微生物生物膜是由细菌、古菌和微真核生物组成的分层有机沉积结构，具有高度的代谢多样性（Seckbach和Oren，2010）。这些微生物群落广泛存在于海洋和淡水环境中（Bolhuis等人，2014）。然而，沿海潮间带的限制性条件促进了生物膜的存在和持续（Paerl和Yannarell，2010）。在Guerrero Negro的出口盐公司（Exportadora de Sal S.A.）的海水蒸发池中，已经开发了30多年来的微生物生物膜，成为微生物生态学研究的重要模型系统（D'Amelio等人，1987）。

#### 生理化学过程的表征

对Guerrero Negro微生物生物膜的生化过程进行表征，确立了有机和无机物质转化的一般生物地球化学途径（Canfield和Des Marais，1993；Des Marais，2003）。白天，真核光合生物（Feazel等人，2008）和蓝藻（Ley等人，2006）通过光合作用产生有机质和氧气，使表层区域氧浓度升高。然而，随着深度增加，氧气浓度逐渐降低，而硫化氢浓度则上升（Ley等人，2006）。这种变化曾被认为限制了硫酸盐还原和其他厌氧过程仅在无氧区域进行。然而，研究表明，硫酸盐还原在白天的有氧层中同样活跃（Canfield和Des Marais，1991）。因此，硫酸盐还原可以被视为生物膜中有机碳矿化的主路径之一（Risatti等人，1994）。夜晚，当光合作用和有氧条件停止，以及可利用氧气的消耗，使得无氧条件从下层扩展至生物膜的上层，促进了光合产物的发酵，并伴随硫化氢的产生（Des Marais，2003；Ley等人，2006）。

#### 甲烷生成的古菌群落

尽管在微生物生物膜中甲烷生成古菌的占比较低，因为该过程仅限于厌氧条件，但主要的甲烷生成途径基于甲基胺和甲醇（García-Maldonado等人，2012；Kelley等人，2015），从而形成了以Methanosarcinales为主的生态群落。其他研究也描述了更广泛的古菌谱系（Smith等人，2008；Robertson等人，2009），包括已知的四种甲烷生成途径（García-Maldonado等人，2023）。

#### 基因标记与代谢潜力

在Guerrero Negro的微生物生物膜中，古菌和细菌群落已通过基因标记进行表征（Ley等人，2006；Harris等人，2013；García-Maldonado等人，2015、2018；Cadena等人，2018；Ramírez-Arenas等人，2024），并更近期的研究探讨了自然条件下的代谢潜力，涉及氮循环（Maza-Márquez等人，2022）以及微生物适应极端嗜盐环境的代谢策略（Maza-Márquez等人，2024）。然而，当前对活跃生物地球化学过程、代谢机制以及介导这些过程的微生物种类的理解仍存在多个空白。

#### 实验设计与数据采集

本研究采用了全宏基因组测序策略，并结合基因组解析方法，对Guerrero Negro的嗜盐分层微生物生物膜进行了分析。在2022年4月，从两个蒸发池（A4N5和A5）中收集了20厘米×30厘米的软平滑生物膜样本，并在采样点的盐水中保存。环境参数在现场进行了测定，结果显示A4N5和A5的盐度分别为80‰和85‰，温度分别为20°C和21.5°C，pH值分别为8.1和8.2。随后，从每个地点选取了七组（0.5厘米深，1厘米直径）的样本进行亚采样。其中三组样本保存在RNAlater中，并在4°C下运输，随后在-20°C下储存，作为未处理样本。另外七组样本则浸入无菌人工盐水中（80‰盐度，73 mM硫酸盐，pH 8.1），在黑暗条件下储存，并在室温下运输。

为了评估生物膜微生物群落对底物添加的响应，使用了微宇宙实验（Ramírez-Arenas等人，2024）。四个处理（每个处理重复三次）包括对照组（未添加底物，N?氛围），H?/CO?氛围（80%–20%）且无底物添加的处理（H?/CO?），H?/CO?氛围（80%–20%）且以三甲胺（15 mM）为底物的处理（H?/CO?-TMA），以及N?氛围且以三甲胺（15 mM）为底物的处理（TMA）。实验过程中，使用无菌血清瓶（50 mL）装有20 mL的处理溶液（人工盐水含或不含底物），并保持生物膜样本的结构完整性。通过用丁基橡胶塞和铝制密封圈诱导无氧氛围，随后用大量N?气体置换空气，再注入处理气体（N?或H?/CO?）持续两分钟。瓶子密封后，在黑暗条件下于22°C下培养85天。

#### 基因组提取与测序

从每个样本（环境或处理）中提取了约2克的总宏基因组DNA，使用DNeasy Power Biofilm试剂盒（QIAGEN，德国）并进行了少量的样本均质化修改（Ramírez-Arenas等人，2024）。同时，进行了一个空白提取（无生物样本）以评估可能的交叉污染。通过1%琼脂糖电泳和NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific，美国）评估DNA的完整性。每个处理的三个重复样本被合并，并进行库制备和高通量测序（2×150 bp），使用HiSeq机器（Illumina，美国）在Azenta Life Sciences（新泽西州，美国）进行。宏基因组原始测序数据已存入NCBI的测序读取档案（SRA）中，项目编号为PRJNA1086882。

#### 测序数据的处理

接收到的十组宏基因组库数据以原始fastq文件形式呈现。初步处理包括使用Trimmomatic v.0.39（Bolger等人，2014）进行质量过滤和读取修剪，并通过Fastq-Screen v.0.15.3（Wingett和Andrews，2018）去除潜在的污染物（人类、PhiX、Lambda、UniVec数据库），保留配对读取。通过sourmash 4.8.3（Irber等人，2022）比较了样本间的k-mer含量。首先，使用khmer v.3.0（Crusoe等人，2015）去除了低丰度的k-mer。接着，使用k=31的签名，以10,000的缩放比例进行签名绘制。在签名比较后，结果通过多维尺度分析（MDS）进行分析，并在R 4.4（R Development Core Team，2021）中使用sourmashconsumr包（https://doi.org/10.57844/arcadia-1896-ke33）进行可视化。

清理后的样本通过Spades v.3.15.5（Nurk等人，2017）在“meta”模式下进行拼接，最低contig长度为1000 nt。拼接后的contigs通过SemiBin2 v.2.0.1进行聚类，该工具采用半监督的孪生神经网络（Pan等人，2023）。使用多聚类的高级工作流程，考虑了样本间丰度差异，以生成每个样本的聚类。

首先，将所有十组样本的contigs合并，然后通过bowtie2 v2.3.5（Langmead和Salzberg，2012）进行reads映射，仅保留映射的reads。通过“SemiBin2 generate_sequence_features_multi”命令获取kmer组成和丰度数据，随后通过“SemiBin2 train_self”和“SemiBin2 bin_short”训练并应用自动监督学习模型构建聚类。之后，使用CheckM v.1.2.2（Parks等人，2015）评估聚类的质量。所有获得的聚类均提交至dRep v.3.5.0（Olm等人，2017）进行去重处理。通过dRep获得的物种代表基因组（作为术语“代表基因组”）使用参数：完成度过滤为50%，污染度为25%，MASH签名大小为1000，fastANI算法（Jain等人，2018），ANI阈值为0.9用于主要聚类，0.95用于次要聚类——仅使用中等至高质量的聚类进行进一步分析。

通过这些聚类获得的基因组代表（MAGs）用于分析自然条件下的微生物群落结构。环境样本的平均质量控制通过数百万条reads进行分析，A4N5和A5的平均reads数分别为40.75和39.68百万。组装结果包括平均207,001和192,975个contigs（长度>1000 bp），对应于A4N5和A5样本。表S1总结了每个样本的序列处理。

#### 处理对群落结构的影响

通过k-mer水平的分析，处理对群落结构的影响被评估。结合排序分析，结果显示出环境样本与处理样本之间的分离（图1，图S1中的第一主成分），表明群落结构发生了变化。样本的另一部分分离是由于其来源地（图1和图S1）。此外，A4N5的对照组和H?/CO?处理样本在相似性上最接近，而A5的H?/CO?和TMA处理样本在相似性上最接近。这些结果表明，处理确实诱导了群落结构的变化，尽管没有与特定底物明确相关。

在后续的数据处理中，基因组聚类产生了1650个聚类，最终在物种水平上去重得到170个中等至高质量的MAGs。其中，163个被分配到细菌域，7个被分配到古菌域。每个样本中约23%的contigs（长度>1000 bp）被用于聚类，它们平均占读取到contigs的58.11%（最小54.62%，最大61.6%）（表S1）。MAGs代表的群落结构与k-mer数据的显著重叠（Procrustes总平方和=0.0847，p<0.001）和高相关性（r2=0.95）表明，MAGs能够有效代表未组装数据中的群落，并反映处理引起的群落变化。

#### 高度多样化的群落结构

通过从宏基因组中提取16S rRNA基因序列，发现了高度多样化的群落，包括42个细菌门和7个古菌门（表S2）。其中，18个门在至少一个样本中相对丰度超过1%（图S2）。处理样本中检测到了环境样本中未检测到的门，以及相对丰度增加的门（表S2），支持了之前观察到的群落变化。

基因组解析策略恢复了属于25个门的细菌MAGs，以及属于4个门的古菌MAGs（图2）。门Chloroflexota的MAGs数量最多，有40个代表，其次是Patescibacteria（24个MAGs）、Bacteroidota（20个MAGs）和Desulfobacterota（15个MAGs）（图2，表S3）。对于古菌，从7个门中恢复了7个代表性的MAGs，包括Halobacteriota（3个MAGs）、Micrarchaeota（2个MAGs）、Nanoarchaeota（1个MAG）和EX4484-52（1个MAG）（图2，表S3）。值得注意的是，25个由MAGs代表的门包括18个在16S中相对丰度超过1%的门，表明恢复了主要和稀有成员。

在家族水平上，通过分析120个细菌或53个古菌单拷贝基因，识别了104个物种。MAGs数据集在家族水平上显示出显著的创新，其中只有35个物种（33%）已有名称（即已描述），50个物种（48%）使用代码命名（即报告的基因组，但未描述的物种），而19个物种（18%）无法分配（表S3，图S3）。在更细的分类尺度（属或种水平），170个MAGs中有109个（64%）无法进行分类（表S3）。在少数能够分配到（已描述）种水平的MAGs中，E22bin.1611被鉴定为Thiohalocapsa halophila（f_Chromatiaceae），而E22bin.1561被鉴定为Salinivirga cyanobacteriivorans（f_Salinivirgaceae）。

基于MAGs的多样性估计，相对丰度为170个MAGs的香农指数范围在4.13到4.51之间（表S1）。在两个地点中，最多样化的样本是A4N5的对照（香农指数=4.51）和A5的H?/CO?处理（香农指数=4.46）。另一方面，Pielou的均匀度值表明，环境样本（A4N5=0.8279，A5=0.8357）和TMA处理样本（A4N5=0.8328，A5=0.8142）显示出略微向更低均匀度发展的趋势（表S1），表明某些物种在这些条件下成为优势种。

总共有76个MAGs在某个样本中相对丰度超过1%，被归类为自然优势或在处理样本中被富集的成员。这些顶级MAGs与23个门（在29个检测门中，占79%）相关。值得注意的是，顶级MAGs包括四个古菌门的成员，表明没有古菌群落被丰度过滤排除。

#### 处理对群落组成的改变

顶级MAGs的相对丰度聚类分析形成了四个群（I到IV）。这些群显示了微宇宙处理对物种群组的显著影响（图3）。群I由12个MAGs组成，它们在环境样本中相对丰度较高，并且主要具有光驱动代谢或依赖这种代谢产物的潜力。两个地点之间共享的MAGs包括蓝藻科Coleofasciculaceae（E22bin.0066）和Elainellaceae（E22bin.0897），γ-变形菌科Beggiatoaceae（E22bin.0981），以及一个可能具有不同碳固定策略的绿色非硫细菌科Chloroflexaceae（E22bin.0036），这些MAGs均具有CBB（rbcL、rbcS、prk）和氮固定（nifD、nifH、nifK）的潜力。推断的硫氧化MAG（E22bin.0981）确实含有广泛的硫化合物氧化机制：硫代硫酸盐到硫酸盐（sox）、硫代硫酸盐到亚硫酸盐（sseA）、硫化物到硫（fccAB）、硫化物到亚硫酸盐（pdo、sqr）、亚硫酸盐到硫酸盐（soeABC）、硫代硫酸盐到四硫代硫酸盐（tsdA）（表S4）。此外，该MAG还显示出与厌氧硫酸盐还原相关的基因（sat、aprAB、dsrAB）。另一个顶级MAG（E22bin.1638）属于未知科的Desulfobacterota，可能具有不同的碳固定策略（3HP和WLP），同样属于两个地点的共享MAGs（图3）。

群II包含在底物处理中相对丰度最高的MAGs，主要集中在A4N5（图3）。A4N5地点的顶级MAGs属于科B4-G1（p_Chloroflexota，E22bin.1277）和BuS5（p_Desulfobacterota，E22bin.0443），这些科具有使用WLP进行碳固定的潜力。此外，SLSP01（p_Chloroflexota，E22bin.1349）和RBG-13-66-14（E22bin.0425）编码硫和硫代硫酸盐的氧化。Caldisericota（E22bin.0411）和Synergistota（E22bin.1423）的MAGs缺乏碳固定或硫循环的基因，但编码了羟胺的处理基因（图3，表S4），并且一个未知科的Desulfobacterota MAG（o_Desulfomonilales，E22bin.1214）具有广泛的代谢潜力，包括WLP、氮固定和硫酸盐、硫和硫代硫酸盐的还原。值得注意的是，群II包括一个与甲烷生成古菌相关的MAG，该MAG在两个地点的TMA处理样本中富集（图3）。

群III包含相对丰度较低的顶级MAGs，或者在特定样本或地点中富集（图3）。例如，前者模式中的MAGs包括异养的Anaerohalosphaeraceae（E22bin.0448）、SLSP01（E22bin.1437）和一个可能的硫酸盐还原者Desulfoplanaceae（E22bin.0671）。而另一些MAGs如Salinivirgaceae的E22bin.1433相对丰度较低，而E22bin.1561仅在A4N5的H?/CO?处理样本中富集，表明其代谢潜力存在差异。编码3HP循环的MAGs（Chloroflexaceae：E22bin.1386、E22bin.0847和E22bin.0848；Rhodobacteraceae：E22bin.1114）和WLP循环的MAGs（Anaerolineaceae：E22bin.0629；B4-G1，E22bin.0105、E22bin.0167、E22bin.0282；Desulfococcaceae：E22bin.0628；以及Desulfomonilaceae：E22bin.0455）也在该群中观察到。

群IV包含仅在A5样本中富集的物种（无论是处理还是未处理的样本）（图3）。这些物种属于异养的Geminicoccaceae科（E22bin.1276），并编码了碳固定Chromatiaceae（CBB；E22bin.1611）、Desulfohalobiaceae（WLP；E22bin.1547）、S140-20（WLP；E22bin.0882）、Desulfococcaceae（WLP；E22bin.0982、E22bin.1125）等。群IV还包含三个古菌顶级MAGs，分别属于GLR71（p_EX4484-52，E22bin.0823）、Methanosarcinaceae（E22bin.1538）和Norongarragalinaceae（p_Micrarchaeota，E22bin.1539）。在群IV中，有两个古菌MAGs具有mcrA基因，其中只有Methanosarcinaceae属于甲烷生成谱系。该MAG仅在TMA添加的样本中富集（图3）。

通过顶级MAGs的相对丰度数据形成的群组并不明显与三种主要元素（C、N、S）的代谢潜力相关。如图3所示，只有群I似乎与CBB碳固定相关，但群IV也包含具有此能力的MAGs。此外，所有Patescibacteria门的MAGs均缺乏所选的基因和代谢途径（图3，图S4）。这一谱系存在于群III（DUUL01，E22bin.0594；JACMRA01，E22bin.0821；JAFGCJ01，E22bin.0351；UBA1369，E22bin.1508）和群IV（GLR71，E22bin.0823；JAHIVN01，E22bin.1497；以及f_，E22bin.1176）。这些结果表明，其他基因、代谢途径或它们的组合可能在塑造群落结构方面更为重要。

#### 群落中主要玩家的代谢潜力

顶级MAGs的代谢能力分解显示了与A4N5和A5环境样本相似的mw-scores（图6）。代谢潜力的分布表明，群落可能依赖于复杂碳、氨基酸和发酵过程（图6）。另一种可能的关键代谢是硫酸盐还原，但不涉及亚硫酸盐还原，表明硫酸盐还原的使用存在差异。尽管大多数功能可能在各层中普遍存在，但某些特定途径在群落的特定部分表现出更高的代表性。

在上层（0–2 mm）中，CBB循环的碳固定能力是特征性的。然而，在这些层中，3HP循环的比例较小但具有特色。酒精（甲醇和乙醇）的氧化和氢气的生成可能也是上层的偏好过程。其他重要的代谢途径包括硫化物和硫代硫酸盐的氧化、氮固定和亚硝酸盐的还原（图6）。后两者可能在夜间发生。总体而言，上层的代谢潜力指向有氧和无氧光合作用。

在下层中，代谢的特点是使用WLP进行碳固定，氧化C1化合物（CO、甲醇、甲醛），脂肪酸的降解，以及硝酸盐的还原和氨化（图6）。硫代硫酸盐的歧化（通过phsA，生成硫化物和亚硫酸盐）可能是重要的硫转化过程。这种代谢潜力与在硫酸盐丰富的无氧环境中生长的厌氧群落相吻合，其生长可能依赖于有机碳化合物作为电子供体和硫化合物作为电子受体。

#### 主要玩家的代谢潜力

蓝藻科Coleofasciculaceae是主要的初级生产者，这一发现与早期研究一致（Canfield和Des Marais，1991；Des Marais，2003）。尽管Guerrero Negro的蓝藻菌株可在菌种库中找到（García-Pichel等人，1998；Marter等人，2025），但据我们所知，这是首次获得该菌株的基因组。该资源的可用性可能有助于后续分析，如特定条件下的基因表达（Burow等人，2013；Woebken等人，2015）。另一蓝藻基因组与Elainellaceae相关（Oculatellaceae，Mai和Johansen，2018），这是首次在Guerrero Negro报道该分类群，并且是Solar Lake微生物生物膜中发现的三种蓝藻分类群之一（Abdallah等人，2024）。蓝藻的主要推断代谢途径与有氧光合作用一致，这可能反映了这两个蓝藻MAGs在处理后受到的影响。

γ-变形菌科Beggiatoaceae显示出与异养硫酸盐还原相关的基因，这些基因可能在反向方向操作，氧化硫为亚硫酸盐（Schedel和Trijper，1979；Schedel等人，1979；Crane，2019；Rudenko等人，2024）。虽然Beggiatoaceae在有氧层中富集，但Thiohalocapsa在除顶层外的所有层中均高度富集。这种不同的垂直分布模式表明，这些潜在的硫代硫酸盐氧化者之间存在生态位分化。该菌株中发现的无氧光合系统II和chlB基因可能是其在生物膜无氧层中的优势因素（Imhoff等人，2018）。

Chloroflexota门以其在微生物生物膜中的多样性和丰富性而闻名（Nübel等人，2001；Ley等人，2006）。在此研究中，识别了五个不同的垂直分布模式，编码了三种不同的碳固定策略。Chloroflexota内部的光合潜力和碳固定能力的差异可能是由于不同的水平基因转移事件（Shih等人，2017）所致。在Chloroflexaceae中，最常见的碳固定策略是3HP循环，可能利用蓝藻在发酵阶段产生的乙酸，与蓝藻有密切的相互作用（Burow等人，2013）。在Chloroflexaceae中检测到CBB循环的基因支持了Guerrero Negro早期的报告（Pierson等人，1994）。另一种可能是，B4-G1科首次在Guaymas盆地（Dombrowski等人，2018）发现，并且也在Shark Bay微生物生物膜中报道（Wong等人，2018），编码了WLP循环进行碳固定。Chloroflexota中的其他潜在厌氧发酵科包括Anaerolineaceae、J111（能够储存碳为聚羟基烷酸酯（PHA））和SLSP01（编码了多种cazyme基因）。值得注意的是，当Anaerolineaceae成员与氢营养型甲烷生成菌共培养时，报告了较高的生长速率（Yamada等人，2005、2006）。Chloroflexota中发现的电子转移酶、氢化酶、运动和转运基因可能参与与其他微生物的潜在相互作用（Burow等人，2013；Bunbury等人，2025）。

Bacteroidota在Elkhorn Slough的微生物生物膜中表现出显著的多样性（8个bin）（Lee等人，2018）。在此研究中，Bacteroidota是第三大代表性门（7个科）。Bacteroidota的科与近饱和池中的常见科不同，如Salinibacteraceae，特别是Salinibacter属（Gómez-Villegas等人，2024），显示了该门在高盐度环境中的高度多样性和适应性。Bacteroidota成员通常被描述为兼性好氧异养生物，与富含碳水化合物的环境相关（Fernández-Gómez等人，2013）。在微生物生物膜中，它们分布在不同层（Ley等人，2006；Farías等人，2014；Wong等人，2016），表明它们在有机质降解中的不同角色和策略。Guerrero Negro的Bacteroidota与Shark Bay微生物生物膜中的Bacteroidota共享氰化物酶基因，编码一种参与降解蓝藻聚合物的酶（Wong等人，2018）。Guerrero Negro中的一个Bacteroidota成员与Salinivirga cyanobacteriivorans（f_Salinivirgaceae）相关。该物种在基里提马蒂环礁的高盐度微生物生物膜中发现，并被描述为专门降解蓝藻生物质的细菌（Hania等人，2017）。对于这一角色，Salinivirga cyanobacteriivorans编码了多种cazyme和蛋白酶基因。Bacteroidota在亚地表含水层和生物反应器中的隔离株显示出通过两种不同机制清除死亡细胞的互补作用：一种隔离株依赖细胞间接触，另一种则分泌裂解酶（Hirakata等人，2023）。此外，这些隔离株依赖与甲烷生成菌的共生关系以最大化降解（Hirakata等人，2023）。因此，Guerrero Negro的Bacteroidota可能在降解上层主要初级生产者产生的复杂物质中扮演类似角色，而下层的成员则可能通过与甲烷生成菌的相互作用提高降解效率。

Desulfobacterota门由8个科组成。在WLP、TCA循环、氮固定甚至其主要特征硫酸盐还原方面的遗传内容差异，可能将这些MAGs置于不同的生态位中。Desulfobacterota成员分布在不同的垂直剖面中，这种分离在基里提马蒂环礁的微生物生物膜中也观察到（Spring等人，2019），可能反映了潜在的代谢差异。Desulfococcaceae科包含WLP基因，但TCA循环的完整性不同，表明该科在碳固定代谢上的多样性，以完全氧化乙酸和其他有机分子为CO?。来自Desulfobacteraceae和Desulfoplanaceae科的两个MAGs缺乏WLP基因，可能通过氨基酸作为电子供体进行硫酸盐还原，并将生成的乙酸转化为CO?，这种策略在红树林沉积物中已被建议用于Desulfobacteraceae（Qian等人，2023）。一个较少研究的分类群，BuS5科，曾在Guaymas盆地的海洋碳渗漏中被描述（Kniemeyer等人，2007），其中显示出完全的碳氢化合物氧化为CO?，甚至对12C-烷烃有偏好。在Guerrero Negro，BuS5的MAGs显示出多样化的硫代谢潜力，表明其能够还原或氧化硫代硫酸盐。BuS5可能使用TMA，从而释放和利用乙酸，这使得BuS5可能与甲烷生成菌竞争这种非竞争性底物。支持这一观察，BuS5在深度>2 mm处的相对丰度较高，表明其可能适应氧化还原条件的变化，而甲基营养型甲烷生成菌则局限于无氧区域。一种可能的适应机制是cydAB基因，它们在微氧条件下被表达（Lemos等人，2001）。这些观察结果与BuS5在A4N5环境样本中的高丰度一致。

甲烷生成古菌与甲基营养型谱系Methanosarcinaceae相关，该谱系被认为是这些高盐度微生物生物膜中的主要甲烷生成菌（Orphan等人，2008；García-Maldonado等人，2015、2018；Kelley等人，2015）。甲烷生成谱系的低丰度可能阻碍其在微生物生物膜中的检测（Wong等人，2018；Martínez-Alvarez等人，2023）。在本研究中，Methanosarcinaceae在使用非竞争性底物TMA时高度富集，加强了其已知的代谢能力（Oren，2014）。然而，在群落水平上，甲烷生成在环境样本中被推断为几乎不存在，以及在推断的环境mm尺度样本的代谢中也匹配了Guerrero Negro低甲烷生成率的报告（Bebout等人，2004；Kelley等人，2012）。

细菌的有氧甲烷营养型基因未被检测到，这与生物地球化学和分子探针报告一致（Bebout等人，2004）。之前通过基因标记报告的潜在有氧甲烷营养型谱系包括细菌门Verrucomicrobiota（García-Maldonado等人，2023）。在本研究中，恢复了该门的两个MAGs，但它们不属于已知的甲烷营养型谱系（Dunfield等人，2007；Guerrero-Cruz等人，2021），因此它们不编码相应的酶。

另一方面，甲烷的厌氧氧化是一种更为复杂的代谢过程，可以通过与硫酸盐、亚硝酸盐和金属的还原相结合的逆向甲烷生成途径进行（Hallam等人，2004；Haroon等人，2013；Bhattarai等人，2019）。最近，通过基因标记方法在这些微生物生物膜中发现了甲烷氧化古菌谱系Methanophagales（ANME-1）和Methanoperedenaceae（以前称为ANME-2d）的迹象（García-Maldonado等人，2023；Maza-Márquez等人，2024；Ramírez-Arenas等人，2024）。这些结果与之前通过不同方法分析的广泛分层一致（Ley等人，2006；Dillon等人，2009；Fike等人，2008），并且总体上与基里提马蒂环礁、Shark Bay和Great Sippewissett沼泽的分层观察相吻合（Schneider等人，2013；Wong等人，2018；Armitage等人，2012）。此外，MAGs提高了参与微生物的分类分辨率。一个明确的例子是Chloroflexota，当在门水平上分析时显示出均匀的垂直分布（Ley等人，2006），而在MAGs分析中则显示出四种不同的垂直分布模式。

#### 研究结论

尽管Guerrero Negro的微生物生物膜已进行了大量研究，但这是首次对该群落进行基因组解析。通过对自然和处理样本的宏基因组测序，我们成功恢复了代表该广泛多样性群落的主要玩家。图7展示了这些主要玩家的潜在代谢过程的概念概述。这些MAGs的代谢潜力支持、确认并连接了之前通过不同生化和分子方法观察到的结果，并揭示了某些谱系中的意外策略。然而，这些基因组的代谢潜力应通过其他分子技术进行评估，这些技术可以区分特定条件下的活跃成员和代谢途径，如全基因组测序结合稳定同位素探针（Malmstrom和Eloe-Fadrosh，2019），或宏转录组学（Campbell等人，2020）。这些结果表明，Guerrero Negro的微生物群落仍然是微生物群落功能研究的重要来源，并且提出了许多新问题。