通过VWFA结构域靶向由CPNE3-RACK1相互作用激活的MET信号通路，以抑制肺癌进展

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Targeting MET Signalling Activated by CPNE3-RACK1 Interaction Through VWFA Domain to Suppress Lung Cancer Progression

非小细胞肺癌中CPNE3通过RACK1/c-MET信号通路促进肿瘤进展，抑制CPNE3或使用MET抑制剂可逆转其功能。

　　非小细胞肺癌（NSCLC）是全球范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一，尽管在诊断和治疗方面取得了显著进展，但其预后仍然较差。因此，探索NSCLC中潜在的分子靶点对于开发新的治疗策略具有重要意义。本研究重点分析了CPNE3蛋白在NSCLC中的作用及其内在机制，特别是通过RACK1/c-MET信号通路对肿瘤生物学行为的影响，并探讨了MET抑制剂在NSCLC治疗中的可行性。研究结果表明，CPNE3在NSCLC组织中显著高表达，并且通过其VWFA结构域与RACK1相互作用，进而激活c-MET信号通路，促进肿瘤的增殖和转移。这一过程可以通过MET抑制剂或RACK1敲低技术在体外和体内得到抑制。因此，CPNE3的发现为NSCLC的治疗提供了新的思路。

CPNE3属于Copine蛋白家族，这一家族的成员在植物和人类中均高度保守。Copine蛋白具有钙依赖性磷脂结合能力，通常在细胞膜和细胞内发挥功能。CPNE3是该家族的重要成员之一，已被证实与多种癌症的发生和进展相关。例如，在乳腺癌中，CPNE3能够通过激活ErbB2蛋白诱导上皮-间质转化（EMT），从而促进癌细胞的侵袭和迁移；在结直肠癌中，低水平的CPNE3与更好的预后相关，提示其可能作为诊断和预后评估的生物标志物；在肝细胞癌中，CPNE3的表达降低可以提高对分子靶向药物的敏感性；而在胶质母细胞瘤中，CPNE3通过激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这些研究均表明，CPNE3在不同类型的癌症中可能具有不同的功能，但其在NSCLC中的具体作用机制仍需进一步探索。

RACK1是一种属于WD重复蛋白家族的蛋白质，与异三聚体G蛋白β亚基具有一定的同源性。RACK1在多种癌症中被发现与EMT相关，并能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移。此外，RACK1可以通过与多个关键蛋白的相互作用调节其功能，从而影响肿瘤的发生和发展。基于此前的研究和实验结果，本研究假设RACK1可能是CPNE3功能的重要介导者，能够促进NSCLC的恶性生物学行为。因此，本研究通过一系列实验验证了这一假设，并进一步探讨了CPNE3与RACK1之间的相互作用机制。

在NSCLC细胞中，CPNE3与RACK1的结合可能通过特定的结构域实现。通过分子对接预测和实验验证，研究发现CPNE3的VWFA结构域与RACK1存在相互作用，这一相互作用可能是CPNE3激活c-MET信号通路的关键环节。进一步的实验表明，CPNE3与RACK1的结合能够显著增强c-MET的磷酸化水平，从而促进下游信号通路的激活，如AKT和ERK。这提示CPNE3可能通过与RACK1的相互作用，间接调控c-MET信号通路，进而影响NSCLC的生物学行为。

为了验证这一假设，研究使用了多种实验方法。首先，通过CCK-8、克隆形成、EdU和Transwell实验，研究了CPNE3对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果显示，CPNE3的表达显著增强了细胞的增殖和迁移能力，而其敲低则抑制了这些过程。此外，细胞周期分析表明，CPNE3的表达会减少处于S期的细胞比例，增加处于G0/G1期的细胞数量，从而抑制细胞增殖。这些结果表明，CPNE3在NSCLC中可能发挥着促进肿瘤进展的关键作用。

在体外实验的基础上，研究进一步通过体内实验验证了CPNE3对NSCLC生长的影响。使用稳定过表达CPNE3的A549细胞在裸鼠体内构建肿瘤模型，结果显示，CPNE3的高表达显著促进了肿瘤的生长，且其抑制剂JNJ-38877605能够有效抑制这一过程。此外，体内实验还表明，JNJ-38877605能够显著降低肿瘤中c-MET和AKT/ERK的磷酸化水平，从而抑制肿瘤的恶性行为。这些结果不仅验证了CPNE3通过RACK1激活c-MET信号通路的机制，还进一步说明了MET抑制剂在NSCLC治疗中的潜在应用价值。

JNJ-38877605是一种小分子的c-MET抑制剂，具有高度的选择性。其对c-MET的抑制效果远高于对其他酪氨酸和丝氨酸激酶的抑制效果，因此被广泛用于研究c-MET信号通路的调控机制。在本研究中，JNJ-38877605被用于体外和体内实验，以评估其对CPNE3诱导的异常激活的抑制效果。实验结果显示，JNJ-38877605能够显著抑制CPNE3过表达细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且能够有效降低c-MET和AKT/ERK的磷酸化水平。这些发现表明，针对c-MET信号通路的抑制剂可能为NSCLC患者提供新的治疗选择，特别是对于那些CPNE3高表达的患者。

研究还发现，CPNE3在NSCLC组织中显著高表达，并且其表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移密切相关。这意味着CPNE3可能是一个重要的预后标志物，能够帮助医生更准确地评估患者的病情和治疗效果。此外，CPNE3的高表达还与较差的生存率相关，提示其在NSCLC中的潜在致癌作用。因此，进一步探索CPNE3在NSCLC中的具体作用机制，有助于开发更有效的治疗策略。

除了体外和体内实验，研究还利用了多种生物信息学方法，包括公共数据库的分析和蛋白互作预测。通过分析TCGA、GEO等数据库，研究发现CPNE3在NSCLC组织中的表达显著高于正常组织，并且与多种致癌通路相关，如免疫系统调节、信号传导和细胞通讯。此外，分子对接预测显示，CPNE3能够与RACK1结合，从而激活c-MET信号通路。这些结果进一步支持了CPNE3通过RACK1调控c-MET信号通路的假设，并为后续研究提供了理论依据。

在实验方法上，研究采用了多种技术手段，包括免疫荧光染色、共免疫沉淀（co-IP）和蛋白芯片检测等。这些方法能够有效验证CPNE3与RACK1之间的相互作用，并进一步分析其对下游信号通路的影响。例如，通过免疫荧光染色，研究发现CPNE3和RACK1在NSCLC细胞中具有共定位现象，这表明它们之间存在直接的相互作用。而通过共免疫沉淀实验，研究进一步证实了CPNE3与RACK1的结合，并发现这种结合主要发生在CPNE3的VWFA结构域。此外，蛋白芯片检测结果显示，CPNE3的过表达显著增加了c-MET的磷酸化水平，提示其可能通过激活c-MET信号通路促进NSCLC的发展。

综上所述，本研究揭示了CPNE3在NSCLC中的重要作用。CPNE3通过与RACK1的结合，激活c-MET信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这些过程可以通过MET抑制剂JNJ-38877605进行有效抑制，表明CPNE3可能成为NSCLC治疗的新靶点。此外，研究还发现，CPNE3的表达水平与患者的预后密切相关，提示其可能作为NSCLC的独立预后因子。这些发现不仅为NSCLC的分子机制提供了新的视角，也为未来的临床治疗提供了潜在的策略。通过深入研究CPNE3与RACK1、c-MET等蛋白之间的相互作用，未来有望开发出更加精准和有效的治疗手段，以改善NSCLC患者的生存率和生活质量。