C6-烷氧基取代的青霉素类化合物是有效的、非共价结合的SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂

《RSC Medicinal Chemistry》：C6-Alkoxy substituted penicillins are potent non-covalently binding inhibitors of the SARS-CoV-2 main protease

本研究通过结构活性关系（SAR）分析和分子动力学模拟，发现青霉素C6位引入烷氧基取代基可显著增强对SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）的抑制活性。大多数衍生物通过非共价结合抑制Mpro，而R-苏氧基取代的青霉素V（如化合物2和3）显示共价结合特征，其抑制活性较对应S-苏氧基衍生物提高约9倍。分子模拟表明，C6-烷氧基的体积和结构影响结合模式，如甲氧基取代物占据S1口袋，而乙氧基和苯氧基取代物则影响结合构象。实验验证了这些取代基的立体效应和电子效应对抑制活性的关键作用，为开发新型非共价Mpro抑制剂提供了依据。

　　在对抗冠状病毒疾病2019（COVID-19）的过程中，针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）主要蛋白酶（M_pro）的抑制剂开发成为重要的研究方向。M_pro作为一种具有亲核性的半胱氨酸蛋白酶，其作用机制是通过切割病毒多聚蛋白（pp1a/1ab）来生成非结构蛋白，从而促进病毒复制。因此，M_pro的抑制可以有效阻止病毒的生命周期，为治疗提供潜在手段。尽管已有多种M_pro抑制剂被开发并应用于临床，如尼马特韦（nirmatrelvir）和恩西特韦（ensitrelvir），但这些药物仍面临一定的挑战，包括病毒变异带来的耐药性以及某些药物在体内代谢中的局限性。这促使科学家们不断探索新的抑制剂策略，以提高治疗效果并扩大应用范围。

近年来，研究者发现，一些β-内酰胺类抗生素，尤其是青霉素衍生物，可能具有抑制M_pro的潜力。青霉素及其衍生物在临床中广泛应用，主要因其能够通过β-内酰胺环与靶标酶中的亲核半胱氨酸发生共价反应，形成稳定的酰基-酶复合物，从而阻断酶的活性。然而，随着病毒变异的出现，一些M_pro抑制剂可能因活性位点的变化而失去效力。因此，探索青霉素衍生物在非共价作用下的抑制机制成为一种新的思路，这不仅有助于克服耐药性问题，还可能为未来的抗病毒药物开发提供更广泛的化学工具。

本研究聚焦于C6-烷氧基取代的青霉素衍生物，分析其对M_pro的抑制作用。通过结合质谱（MS）和计算模拟的方法，研究团队发现大多数C6-烷氧基取代的青霉素在与M_pro结合时，主要通过非共价作用占据酶的活性位点，从而实现对病毒蛋白酶的高效抑制。这一发现不仅为理解青霉素的抗病毒机制提供了新视角，还提示我们，β-内酰胺类化合物在某些情况下可以采用非共价的抑制方式，而不仅仅依赖于传统的共价反应机制。值得注意的是，某些C6-烷氧基取代的青霉素衍生物（如（R）-磺氧化物）表现出不同程度的共价反应能力，这表明青霉素的结构修饰可能影响其作用机制。

为了验证这些结构变化对抑制效果的影响，研究人员合成了一系列C6-烷氧基取代的青霉素V和青霉素G衍生物，并对其在M_pro抑制中的表现进行了系统评估。实验结果显示，C6-烷氧基取代的青霉素在抑制效力上表现出显著差异，其中某些结构更有利于非共价结合，而另一些则可能在特定条件下发生部分共价反应。例如，C6-甲氧基取代的青霉素V（如（R）-磺氧化物）在非共价结合的机制下表现出较高的抑制活性，而其对应的硫酮衍生物则显示出较低的效力。这种差异可能与取代基的立体效应和电子效应有关，进而影响分子与酶的结合方式和亲核攻击的效率。

此外，研究团队还通过分子动力学（MD）模拟分析了不同取代基对青霉素与M_pro结合模式的影响。模拟结果显示，C6-烷氧基取代的青霉素倾向于占据酶的S1或S1'口袋，这与传统β-内酰胺类药物通过共价反应与S145半胱氨酸形成稳定复合物的机制有所不同。非共价结合的机制可能更依赖于分子与酶活性位点之间的氢键相互作用，而非直接的共价键形成。这种机制的优势在于其可能对酶的变异具有更高的适应性，因为非共价结合通常不会受到酶活性位点细微变化的影响，从而降低耐药性的风险。

研究还发现，某些C6-烷氧基取代的青霉素在与M_pro结合后，可能形成短暂的共价中间体，如脱水产物或硫代产物，这些中间体可能在一段时间内转化为更稳定的非共价结合状态。例如，C6-甲氧基取代的青霉素G（R）-磺氧化物衍生物在45分钟内显示出与M_pro形成共价加合物的迹象，但随着时间推移，这种加合物的形成似乎变得缓慢。这种现象可能与酶活性位点的动态变化有关，也可能反映了分子在结合过程中的不同反应路径。

值得注意的是，研究中还观察到某些C6-烷氧基取代的青霉素在与M_pro结合时，可能产生某些特殊的化学修饰，如半胱氨酸硫醇的氧化产物。这些产物的形成可能影响酶的活性，但目前尚无法明确其具体的化学性质。由于质谱分析的分辨率限制，这些修饰的类型（如磺酸或过硫化物）无法被直接区分，因此需要进一步的实验和分析来确认其作用机制。

除了M_pro的抑制，研究还发现C6-烷氧基取代的青霉素在其他酶系统中也具有潜在的抑制作用。例如，某些C6-烷氧基取代的青霉素磺酮（如27a、27b、27f）已被报道为人类白细胞弹性蛋白酶（HLE）的共价抑制剂，这表明β-内酰胺类化合物可能具有更广泛的酶靶标范围。然而，这些化合物在与M_pro结合时，可能不会表现出类似的共价反应能力，这进一步说明了不同酶的结合机制可能具有显著差异。

研究还指出，青霉素的C6-烷氧基取代可能对其与SARS-CoV-2 M_pro的结合方式产生重要影响。例如，C6-甲氧基取代的青霉素在与M_pro结合时，可能占据不同的口袋区域，从而改变其与酶的相互作用模式。这一发现为未来开发更高效的抗病毒药物提供了理论依据，也表明青霉素的结构修饰可以显著影响其作用机制。

此外，研究还探讨了青霉素衍生物在不同硫氧化状态下的抑制能力。实验结果显示，硫醇（sulfide）、磺氧化物（sulfoxide）和磺酮（sulfone）等不同氧化态的青霉素衍生物在M_pro抑制中的表现存在差异。其中，某些磺氧化物表现出比硫醇更高的抑制活性，这可能与其更稳定的结合方式有关。同时，某些结构特征（如立体中心的构型）也可能影响其与M_pro的相互作用，进而影响抑制效果。

综上所述，C6-烷氧基取代的青霉素衍生物在抑制SARS-CoV-2 M_pro方面展现出独特的潜力。这些化合物可能通过非共价结合的方式实现对病毒蛋白酶的高效抑制，为未来的抗病毒药物开发提供了新的思路。同时，研究还揭示了青霉素结构修饰对抑制机制的深刻影响，为理解β-内酰胺类化合物在不同酶系统中的作用提供了重要的理论基础。这些发现不仅有助于开发更有效的抗病毒药物，也为克服现有药物的耐药性问题提供了可能的解决方案。