引导RNA热变性对Cas9核糖核蛋白负载的脂质纳米颗粒制剂质量的影响

《RSC Pharmaceutics》：The effect of guide RNA thermal denaturation on the quality of Cas9 ribonucleoprotein-loaded lipid nanoparticle formulations

基因编辑治疗中，sgRNA热变性显著改善RNP负载LNP的均一性、封装效率和肝细胞靶向性，使基因敲除活性提升并增强冷冻耐受性，为遗传病治疗提供新策略。

　　基因编辑技术在治疗遗传疾病方面展现出巨大的潜力，尤其是CRISPR/Cas9技术的出现，为精准修改DNA序列提供了新的可能性。CRISPR/Cas9是一种由Cas9蛋白和单链引导RNA（sgRNA）组成的复合物，能够靶向特定的DNA序列并实现基因的切割或编辑。随着该技术的不断进步，其在临床前研究和实际应用中的重要性日益增加。然而，如何高效且特异性地将CRISPR/Cas9复合物递送到目标细胞或组织，仍然是基因编辑治疗面临的关键挑战之一。

在众多递送方法中，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）因其非病毒特性、良好的生物相容性以及较低的免疫原性，成为一种极具前景的载体。LNPs能够包裹核酸和蛋白质，使其顺利穿过细胞膜，进入细胞内部，从而实现基因编辑的目的。特别是基于RNP（Ribonucleoprotein）的递送方式，即直接将Cas9蛋白与sgRNA结合后封装进LNPs中，避免了RNA转录和翻译的过程，提高了基因编辑的效率和安全性。尽管RNP递送技术在近年来得到了广泛关注，但其在实际应用中的优化和深入研究仍然相对有限。

在本研究中，科学家们探讨了sgRNA结构异质性对RNP封装后的LNP制剂内部结构、物理特性和基因敲除活性的影响。他们发现，未经热变性的sgRNA往往形成结构复杂的复合物，这不仅影响了其与Cas9蛋白的结合效率，还可能降低其在LNP中的封装效率和活性。此外，这种结构异质性还可能导致RNP在体内的分布不均，从而影响治疗效果。而通过热变性处理sgRNA，可以显著减少其形成多聚体的趋势，使其更倾向于形成均匀的单体结构，从而提高RNP的封装效率和体内的基因敲除活性。

研究中使用了多种实验方法来验证这一假设，包括凝胶电泳、圆二色光谱（CD）、质谱成像（mass photometry）和冷冻透射电镜（cryo-TEM）等。通过这些手段，研究人员能够定量分析sgRNA的分子量分布、二级结构变化以及RNP在LNP中的封装情况。结果显示，热变性处理后，sgRNA的结构变得更加均匀，其与Cas9形成的RNP也表现出更高的封装效率和更一致的物理特性。此外，热变性处理还显著提高了RNP在体内的靶向性和基因敲除效果。

值得注意的是，热变性处理后的RNP-loaded LNPs表现出更好的耐冻融性能，这为基因编辑制剂的长期储存和运输提供了便利。同时，这些制剂在新生儿小鼠模型中成功诱导了TTR基因的敲除，这为未来在儿科领域的应用提供了重要支持。目前，基因治疗在儿科中的应用仍处于探索阶段，许多药物的审批流程主要针对成人，而针对儿童的个性化治疗方案则相对较少。然而，随着“N-of-1”疗法的发展，即针对个体基因突变定制基因编辑治疗方案，基因治疗在儿童中的应用前景变得越来越广阔。

此外，研究还指出，热变性处理不仅改变了sgRNA的结构，还影响了RNP在LNPs中的物理特性。例如，热变性后的RNP-loaded LNPs表现出更小的粒径和更均匀的形态，这可能有助于其在体内更有效地靶向肝细胞。肝细胞是许多遗传疾病治疗的靶点，例如由TTR基因突变引起的淀粉样变性。通过优化sgRNA的结构，研究人员能够提高基因编辑的效率和靶向性，为临床治疗提供了新的思路。

总体来看，这项研究揭示了sgRNA结构异质性对基因编辑效率和递送效果的重要影响，并提出了通过热变性处理来优化RNP-loaded LNP制剂的策略。这种优化不仅提高了制剂的稳定性，还增强了其在体内的基因敲除活性，为基因治疗在遗传疾病中的应用提供了有力支持。同时，该研究也为未来在儿科基因治疗领域的探索奠定了基础，特别是在针对罕见遗传病的个性化治疗方面。随着技术的不断成熟和临床试验的推进，基于RNP-loaded LNP的基因编辑疗法有望成为治疗遗传疾病的重要手段之一。