基于浸没技术的清除方法与心肌组织中的自发荧光淬灭现象

《Microcirculation》：Immersion-Based Clearing and Autofluorescence Quenching in Myocardial Tissue

心肌组织 cleared and 3D microvascular imaging using immersion-based tomato lectin labeling and CUBIC clearing reagents. Methods: Delipidation with optimized CUBIC Reagent I (24h total, 50% diluted phase) improved SNR up to 150μm depth. Autofluorescence quenching tests showed TrueBlack and Sudan Black B reduce imaging depth, while Glycine and TrueVIEW maintain depth with stable SNR. Results: Rat samples achieved higher SNR (1.77) than pig (1.38), with optimal delipidation at 24h. Comparative quenching revealed TrueVIEW and Glycine best balance SNR and depth.

　　近年来，随着光学显微镜技术和组织制备方法的不断进步，我们已经能够对复杂的微血管网络进行三维可视化。组织清除技术有助于改善光穿透性并延长成像深度，为研究组织内部结构提供了重要支持。传统的血管标记和组织清除方法通常依赖于灌注技术，这种技术虽然有效，但在处理大型动物模型的组织时，浸入式方法则表现出更高的实用性。本文提出了一种适用于心肌组织的浸入式血管标记与组织清除协议，使用番茄凝集素和CUBIC（一种用于组织透明化的试剂）进行操作，并展示了其在最大成像深度150微米下的有效性。此外，本文还优化了该协议中的去脂和淬灭步骤，并通过信号强度和平均z切片强度的自动分析来评估图像质量。

在显微镜成像领域，微血管的可视化一直是重要的研究方向。微血管不仅在组织内物质交换和气体交换中发挥关键作用，而且对于研究疾病状态下血管结构的适应性及对心肌灌注的影响也具有重要意义。传统的显微镜成像方法如二维组织学虽然可以用于描述血管壁组成和量化血管密度，但其数据局限于薄切片，无法提供微血管网络的三维连接信息。相比之下，使用三维体积数据的显微镜技术，如微CT或荧光显微镜，可以更全面地观察血管结构。然而，微CT在观察毛细血管网络时存在一定的局限性，主要在于空间分辨率不足以及灌注材料的粘稠性可能影响毛细血管的完整填充。而荧光成像则能够在亚微米级别的空间分辨率下获取血管结构的图像。

本文提出的浸入式方法为小样本或生物样本的组织清除和血管标记提供了一种有效的替代方案。对于富含血红素的器官如心肌，使用浸入式方法可以避免传统灌注方法中需要大血管插管的问题，从而适用于较小的组织切片或捐献组织。组织清除方法旨在纠正组织中的折射率（RI）不匹配，并减少因折射率不一致导致的光散射。常用的技术包括去除脂质和其他散射分子、分解胶原蛋白或脱水处理等。此外，脱色处理（去除光吸收性色素）也有助于提高光穿透深度。

CUBIC（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis）是一种专门为全脑成像设计的组织清除方法，但已被广泛应用于其他器官和组织的清除研究。在本研究中，我们对心肌组织进行了组织清除，并使用番茄凝集素进行血管标记，成功实现了300微米切片的成像。此外，我们还优化了该协议中的组织清除步骤，以提升信号与噪声比（SNR）和成像深度。进一步地，我们引入了一种可选的自动荧光淬灭步骤，以评估不同淬灭剂对组织清晰度的影响，并探索其对信号强度和成像深度之间的潜在权衡。

实验结果显示，使用CUBIC试剂I进行24小时的浸入处理可以达到最佳的图像质量。淬灭剂TrueVIEW、甘氨酸和台盼蓝并未显著影响SNR值，而TrueBlack和苏丹黑B则显示出成像深度下降的趋势。总体而言，小鼠心肌组织的SNR值高于猪心肌组织。这些结果表明，浸入式方法在优化血管标记和组织清除过程中具有一定的优势，但需要进一步研究以明确不同淬灭剂对成像深度的具体影响。

在实验过程中，我们使用了多种方法来评估图像质量，包括计算平均z切片强度和SNR。我们发现，较长的CUBIC试剂I浸入时间可能导致信号强度的下降，而适度的浸入时间（如12小时或24小时）则能够提供较高的SNR。此外，不同的淬灭剂对组织清晰度和SNR的影响也各不相同。例如，TrueBlack和苏丹黑B虽然在表面能够有效提高SNR，但会降低整体的成像深度。而TrueVIEW和甘氨酸则在提升SNR和成像深度方面表现较好，值得进一步研究。

本文还探讨了不同淬灭剂对心肌组织的影响。我们发现，TrueBlack和苏丹黑B虽然能够有效减少组织的自动荧光，但它们的使用会降低成像深度。相比之下，TrueVIEW和甘氨酸在提升信号强度和成像深度方面表现更为平衡，显示出一定的应用潜力。这些结果表明，选择合适的淬灭剂对于提升图像质量至关重要。然而，目前尚无研究专门探讨淬灭剂对清除后的组织成像深度的影响。

本文的实验设计采用了因子设计的方法，对关键实验参数进行了优化。通过使用不同的淬灭剂和不同的CUBIC试剂I浓度，我们评估了它们对图像质量的影响。实验结果显示，CUBIC试剂I的浓度和浸入时间对信号强度和成像深度均有一定影响。我们还发现，不同的淬灭剂对组织的自动荧光有不同效果，这可能与它们的分子结构和作用机制有关。

本文的成果表明，浸入式方法在心肌组织的清除和成像方面具有重要价值。通过优化浸入时间、浓度和淬灭剂的选择，我们能够成功实现对毛细血管网络的成像，并为未来研究心肌微血管结构提供了坚实的理论基础。此外，我们还展示了信号强度随成像深度的变化趋势，这有助于理解不同成像方法在不同深度下的表现。

总的来说，本文提出了一种适用于心肌组织的浸入式血管标记和组织清除协议，并通过实验验证了其在提高图像质量和成像深度方面的有效性。该方法为研究不同物种心肌组织的微血管结构提供了新的思路，并为未来的疾病状态分析和生物物理模拟奠定了基础。此外，本文还强调了不同淬灭剂在提高信号强度和减少自动荧光方面的潜在应用，为未来的研究提供了参考。