人类柠檬酸合酶的翻译后修饰现象以及分子动力学模拟表明乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）与辅酶A（CoA）之间的结合强度有所减弱

《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》：Human Citrate Synthase Post-Translational Modification Mimics and Molecular Dynamic Simulations Demonstrate Attenuation of Acetyl-CoA/CoA Binding

柠檬酸合酶（hCS）翻译后修饰（PTM）对代谢功能的影响。通过定点突变、稳态动力学及分子动力学模拟，发现hCS K393乙酰化（K393Q）显著降低AcCoA结合亲和力，使Km增加30倍，而催化效率（kcat/Km）未受显著影响。MD模拟显示乙酰化削弱K393与CoA的相互作用。其他PTM如K395甲硫ylation（K395M）和磷酸化（S225E/S232E/Y381E/Y80E）同样影响酶活性，其中Y80磷酸化（Y80E）导致kcat下降10倍。研究揭示了PTM如何通过改变底物结合和催化步骤调控TCA循环及代谢相关疾病。

　　本文探讨了人类柠檬酸合酶（hCS）在翻译后修饰（PTM）方面的功能影响，重点分析了不同PTM对hCS催化活性及底物结合能力的作用。hCS是线粒体中的一种关键酶，其主要功能是催化乙酰辅酶A（AcCoA）与草酰乙酸的缩合反应，生成柠檬酸并释放辅酶A（CoA），这是三羧酸循环（TCA循环）的第一步。由于hCS在代谢过程中起着核心作用，其活性常被用作衡量线粒体功能的指标。此外，hCS在有氧运动表现和基础代谢功能中也具有重要作用。

研究表明，hCS的多个残基位点通过乙酰化、磷酸化和甲基化等PTM方式被修饰。然而，关于这些修饰对hCS活性的具体影响，目前的研究仍较为有限。为了深入理解这些修饰对酶功能的潜在影响，研究团队采用了一种结合分子动力学（MD）模拟与稳态动力学分析的方法，对hCS中与活性位点接近或远离的多个PTM模拟突变体进行了系统性研究。

研究发现，大多数PTM对AcCoA的k_cat/K_m值产生了负面影响，但对草酰乙酸的k_cat/K_m影响相对较小。其中，K393位点的乙酰化模拟突变体K393Q对AcCoA的K_m产生了显著的增加，约提高了30倍，而对k_cat值没有明显影响。这一结果表明，K393位点的乙酰化可能主要影响AcCoA的结合能力，而对催化过程本身影响较小。为了进一步验证这一结论，研究团队还对26种PTM和突变体进行了MD模拟，结果显示K393AcK突变体在AcCoA/CoA结合方面表现出最显著的减弱。

研究团队还利用猪心柠檬酸合酶（pig heart CS）的晶体结构作为参考，分析了hCS中K393和K395位点的结构位置及其与底物的相互作用。猪心CS的K366和K368位点在结构上与hCS的K393和K395位点相对应，并且这些位点在不同的构象变化中表现出高度动态的特征。MD模拟显示，K366在猪心CS的“闭合”构象中与CoA的结合非常紧密，而K368则倾向于与溶剂接触。因此，K393和K395在hCS中可能对底物的结合起到重要作用。

为了更全面地评估这些PTM对hCS活性的影响，研究团队还对其他PTM位点进行了突变模拟。例如，K395的甲基化模拟突变体K395M表现出对AcCoA结合能力的一定影响，其K_m值较野生型（WT）有所上升，同时k_cat/K_m值下降。此外，对Y80、Y381等磷酸化位点的突变分析也显示了其对酶活性的显著影响，其中Y80E突变体的k_cat值下降了10倍，而AcCoA的K_m值无法可靠测定。这些结果进一步支持了PTM对hCS活性的调节作用，尤其是在影响底物结合能力方面。

研究还指出，尽管通过基因编码扩展技术可以生成真正的PTM，但在实际实验中，由于纯化难度较大，研究团队选择了传统的定点突变方法来模拟PTM。这种方法虽然不能完全复制PTM的实际效果，但能够提供有价值的线索，以进一步探索PTM对hCS功能的影响。此外，研究还强调了MD模拟在理解PTM影响中的重要性，特别是在预测不同修饰对底物结合能力的改变方面。

综上所述，这项研究揭示了hCS中多个PTM位点对酶活性和底物结合能力的潜在影响。通过结合MD模拟与稳态动力学分析，研究团队为理解PTM在代谢调控中的作用提供了新的视角。这些发现不仅有助于进一步揭示hCS在代谢过程中的功能机制，也为研究代谢相关疾病（如心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌症）提供了新的思路。此外，研究还强调了PTM在调节有氧代谢和运动能力中的可能作用，提示未来可以通过调控这些修饰来探索新的治疗策略。