通过使用牺牲性颗粒水凝胶策略改进器官芯片模型，以增强其渗透性和生物仿生性能

《Small Methods》：Advancing Organ-on-Chip Models With a Sacrificial Granular Hydrogel Strategy for Enhanced Permeability and Biomimicry

骨 marrow-on-chip 模型中采用反向颗粒水凝胶策略，通过预嵌合可溶性藻酸盐微凝胶（ALG μgels）与纤维蛋白-胶原蛋白（FIB-COL）水凝胶，经酶解/化学处理去除微凝胶形成高连通多孔结构，显著降低流体阻力（减少15倍），促进纳米至微米级颗粒和细胞（如红细胞、间充质干细胞、内皮细胞）渗透，并优化细胞分布和原始血管网络形成，为感染性疾病建模提供新型3D微环境工具。

　　这项研究提出了一种创新的“反向”颗粒水凝胶策略，旨在解决传统水凝胶在器官芯片模型中模拟感染过程时所面临的挑战。水凝胶作为组织工程和生物医学研究的重要工具，其结构和性能对于模拟复杂的生物微环境至关重要。然而，常规的水凝胶由于其较小的网格结构，往往无法有效支持病原体迁移和细胞-病原体相互作用，这限制了其在模拟感染动态方面的应用。为了克服这一限制，研究人员开发了一种新的方法，通过将可牺牲的藻酸盐（ALG）微凝胶（μgels）嵌入到纤维蛋白-胶原蛋白（FIB-COL）前体溶液中，随后在原位进行酶促/化学溶解，从而生成具有高度孔隙率的pFIB-COL水凝胶。这种方法不仅提高了水凝胶的渗透性，还改善了流体流动、模型粒子和细胞在芯片内的迁移能力，同时保持了水凝胶的基本结构完整性。这一策略为构建更精确的感染模型提供了新的思路，特别是在模拟骨髓（BM）等复杂组织时。

研究首先聚焦于如何精确控制ALG微凝胶的大小和形态。通过高通量的气流辅助滴注法，研究人员成功制备了直径在50-100微米范围内的ALG微凝胶。这一尺寸范围能够有效促进纳米级、微米级的病原体和细胞的渗透。研究人员测试了不同参数，包括ALG浓度（1-3 wt.%）、气流压力（0.1-4 bar）、针头与凝胶浴之间的距离（7、14和21厘米）以及CaCl?溶液的摩尔浓度（100或200 mM）。结果表明，2 wt.%的ALG溶液在气流压力为2 bar、针头距离为21 cm和CaCl?浓度为200 mM的条件下，能够生成尺寸均匀、形态规则的微凝胶。这些微凝胶在后续的模拟实验中扮演了关键角色，它们的去除过程为水凝胶内部创造了可渗透的微孔结构。

为了构建骨髓芯片（BM-on-chip），研究人员设计了一个包含两个主要通道的微流控平台：一个用于容纳水凝胶的骨髓腔室和一个用于模拟微循环的侧血管通道。通过使用3D打印技术，研究人员成功制造了结构复杂、具有1×1 mm截面的骨髓腔室和0.2×1 mm截面的侧血管通道。这两个通道通过15个间距为0.6 mm的细缝相互连接，以确保物质可以在两个腔室之间自由交换，同时避免液体泄漏或堵塞血管通道。这种设计不仅提升了水凝胶的可渗透性，还为研究感染过程提供了更接近生理条件的实验环境。

随后，研究人员探讨了ALG微凝胶在FIB-COL水凝胶中的整合与去除对微孔结构的影响。通过不同浓度的ALG微凝胶（200至6000个/微升），他们发现只有当微凝胶密度超过2000个/微升时，才能在水凝胶内部形成相互连通的微孔结构。通过共聚焦显微镜图像分析，他们进一步验证了这一发现，表明ALG微凝胶的含量直接影响了水凝胶的孔隙率和微孔分布。去除微凝胶后的pFIB-COL水凝胶表现出更高的孔隙率（超过80%），相比原始FIB-COL水凝胶（孔隙率约为53%）具有显著优势。这种高度孔隙的结构不仅改善了流体流动的阻力，还增强了水凝胶对各种生物实体（如病毒、寄生虫和感染红细胞）的渗透能力。

研究还评估了pFIB-COL水凝胶对细胞活力的影响。通过在不同水凝胶条件（FIB-COL、gFIB-COL和pFIB-COL）下进行2天的芯片培养，研究人员发现所有水凝胶中的细胞均表现出良好的存活率（超过80%），且细胞分布均匀。这表明，即使在水凝胶中整合了ALG微凝胶，并在去除后形成高度孔隙的结构，也不会影响细胞的活性。特别是对于更敏感的红细胞（erythroblasts），其在pFIB-COL水凝胶中的存活率同样很高，说明该策略在细胞培养和感染研究中具有良好的适用性。

此外，研究人员还研究了pFIB-COL水凝胶对原始血管网络形成的支持作用。在模拟实验中，将骨髓间质干细胞（BM-MSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养于pFIB-COL水凝胶中，发现其能够促进更稳定、更广泛的内皮网络形成。通过AngioTool软件分析，研究人员观察到pFIB-COL水凝胶中的血管网络覆盖面积更大，平均血管长度更长，分支指数更高，而结构的不均匀性（lacunarity）更低。这些结果表明，pFIB-COL水凝胶不仅能够支持细胞的均匀分布，还能够模拟更接近真实组织的血管网络，为研究宿主-病原体相互作用提供了更理想的实验平台。

研究进一步验证了pFIB-COL水凝胶在模拟感染过程中的性能。通过将不同尺寸的模型粒子（如200纳米的纳米珠、2微米的微珠和8-10微米的红细胞）引入芯片的血管通道，研究人员发现这些粒子在pFIB-COL水凝胶中的渗透能力显著优于在FIB-COL水凝胶中的表现。在pFIB-COL水凝胶中，粒子能够更深入地迁移至骨髓腔室，而在FIB-COL水凝胶中，粒子则主要聚集在通道与水凝胶交界处。这一现象表明，pFIB-COL水凝胶的高孔隙率能够有效促进病原体和细胞在芯片中的迁移和分布，从而更真实地模拟感染过程。

研究人员还探讨了pFIB-COL水凝胶的流体动力学特性。通过建立一个微流控系统，他们测量了FIB-COL和pFIB-COL水凝胶的流体阻力和渗透性。结果显示，pFIB-COL水凝胶的流体阻力显著低于FIB-COL水凝胶，大约降低了15倍。这种降低的阻力使得流体能够更高效地通过水凝胶，从而提升了整体的渗透能力。同时，通过改变水凝胶的截面面积和长度，研究人员计算了水凝胶的渗透率（permeability），并发现pFIB-COL水凝胶的渗透性明显优于FIB-COL水凝胶。这些结果进一步证明了pFIB-COL水凝胶在模拟感染过程中具有更高的流体传输效率。

为了进一步验证pFIB-COL水凝胶的结构特性，研究人员使用了冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）进行分析。显微镜图像显示，原始FIB-COL水凝胶的结构较为致密，而去除ALG微凝胶后的pFIB-COL水凝胶则呈现出明显的孔隙结构。这些孔隙不仅分布均匀，而且大小适中，能够有效促进细胞和病原体的迁移。同时，pFIB-COL水凝胶的机械特性得到了保留，这表明其能够维持骨髓微环境的生物相似性，从而支持更真实的感染模型。

本研究还探讨了pFIB-COL水凝胶在不同实验条件下的适用性。例如，通过调整ALG微凝胶的含量和去除条件，研究人员能够根据不同的实验需求，灵活控制水凝胶的孔隙率和渗透性。这种策略不仅适用于FIB-COL水凝胶系统，还能够推广到其他类型的水凝胶材料，为多种生物医学研究提供了新的可能性。此外，研究人员还强调了未来研究的方向，包括评估水凝胶的长期稳定性和降解动力学，以及更深入地研究细胞在高度孔隙结构中的行为和表型变化。这些研究将进一步推动pFIB-COL水凝胶在感染模型、药物筛选和疾病研究中的应用。

总之，这项研究提出了一种“反向”颗粒水凝胶策略，通过将可牺牲的ALG微凝胶嵌入到FIB-COL水凝胶中，并在适当条件下去除，成功生成了具有高度孔隙率的pFIB-COL水凝胶。这种策略不仅提升了水凝胶的渗透性和流体传输能力，还支持了细胞的均匀分布和原始血管网络的形成，为构建更精确的感染模型提供了新的工具。未来，随着该技术的进一步优化，有望在更多复杂的生物医学研究中发挥重要作用。