双层液滴阵列能够在高通量细菌培养过程中动态调控细胞微环境

《Small Methods》：Two-Layer Droplet Arrays Enable Dynamic Manipulation of Cell Microenvironment During High-Throughput Bacterial Cultivation

本研究提出了一种双层微滴平台，通过快速交换水相层实现纳米级琼脂糖微滴内试剂的精准添加与移除。实验验证了该平台在抗生素静态与动态暴露测试中的高效性，发现细菌对药物响应存在显著单细胞异质性，并成功实现了72小时慢速生长的枯草芽孢杆菌长期培养。平台支持高通量药物筛选、动态环境模拟及生物体长期观测。

　　在生物化学和微生物学研究中，高通量、微尺度的实验方法正变得越来越重要。本文介绍了一种创新的微滴阵列平台，它通过双层微滴结构实现对微滴微环境的灵活操控，从而支持动态生物培养。这种技术的核心在于，将含有细菌细胞的琼脂糖微滴固定在开放基底上，随后在这些琼脂糖微滴上方沉积一层具有特定组成的水滴，从而形成一个薄层的液体环境。通过这种设计，可以实现快速的化学物质交换，并且还能移除水滴层，从而提取琼脂糖微滴中已经加入的物质。这一特性为抗生素药物测试提供了新的可能性，使研究者能够在静态和瞬时暴露条件下对细菌进行分析。

琼脂糖微滴的形成依赖于精确的液滴生成技术，其体积约为2.0纳升，而水滴的体积则约为3.7纳升。这种微滴阵列能够支持对数千个微滴的操控，使得实验操作更加高效。通过控制微滴的体积和沉积方式，研究者可以实现对细胞微环境的精确调节，从而在不同条件下进行培养。例如，在研究抗生素对细菌的影响时，可以首先在琼脂糖微滴中加入一定浓度的抗生素，观察其对细菌的杀灭效果，随后移除抗生素，以研究细菌的复苏情况。这种动态的微滴微环境模拟了实际环境中微生物可能经历的复杂条件，从而更真实地反映其生物学行为。

此外，该平台还支持长期培养实验。以缓慢生长的微生物为例，研究者可以通过定期补充培养基来维持其生长，即使在纳米升体积的微滴中也能实现长达72小时的培养。这种能力对于研究那些难以在传统方法中维持的微生物尤为重要，例如某些慢生长的细菌或需要特定营养条件的微生物。通过这种方式，研究者可以更深入地理解微生物在不同环境条件下的适应性与生存策略。

在实验过程中，琼脂糖微滴的结构保持稳定，即使在多次液体沉积和移除后，其内部的细胞和不可溶物质仍能保持原位。这种稳定性对于需要多次干预的实验至关重要，例如在药物筛选中，需要对同一微滴进行多次药物添加和移除操作，以观察细胞对药物的反应。同时，由于琼脂糖微滴能够提供一个相对封闭的环境，研究者可以在不干扰细胞的情况下，进行高通量的培养和分析。

实验中使用的琼脂糖具有较低的凝胶化温度，这使得其能够在细胞相容的温度下（如37°C）进行沉积，同时不影响后续的水滴层添加和移除。这种设计不仅确保了细胞的存活，还提高了实验的可重复性和可控性。在进行药物测试时，通过不同的浓度梯度，可以系统地研究药物对细菌的影响，并确定最小抑菌浓度（MIC）。同时，该平台还支持对药物去除后的细胞复苏进行观察，从而揭示细胞在不同环境条件下的异质性反应。

为了进一步验证这一技术的可行性，研究者还进行了多种实验，包括荧光染料的添加和移除、细菌生长的观察以及不同培养条件下的细胞存活率分析。实验结果表明，该平台能够实现快速、均匀的化学物质交换，并且能够有效移除之前添加的物质。这种特性不仅适用于抗生素测试，还可以用于其他需要动态调控微环境的研究，如药物筛选、细胞筛选等。

在长期培养实验中，通过定期补充培养基，研究者能够维持缓慢生长的微生物的活性，使其在微滴中继续生长。这种补充过程不仅能够提供必要的营养，还能防止由于水分流失导致的微滴体积缩小。同时，研究者还观察到，在不同的补充条件下，微生物的生长情况存在显著差异，这为研究微生物之间的相互作用提供了新的视角。

总的来说，这种双层微滴阵列平台为生物化学和微生物学研究提供了一种全新的工具。它不仅能够实现高通量的微滴操控，还能支持动态微环境的创建，从而更真实地模拟生物体内的复杂条件。此外，该平台还具备较高的灵活性，可以用于多种实验场景，包括药物测试、细胞复苏研究以及长期培养实验。这些特性使其成为研究微生物行为和开发新型药物筛选方法的重要工具。