ScHAL1介导的大豆耐盐性增强：从稳定的转基因遗传到田间试验验证

《Plant Biotechnology Journal》：ScHAL1-Mediated Enhancement of Salt Tolerance in Soybean: From Stable Transgenic Inheritance to Field Trial Validation

盐胁迫下通过过表达酵母ScHAL1基因提高大豆耐盐性。采用农杆菌介导法将ScHAL1和bar基因转入大豆品种'Williams 82'，获得TL1、TL2、TL3三个稳定遗传的转基因株系。分子生物学检测（PCR、Southern blot）证实ScHAL1和bar基因在T4-T6代稳定整合表达。生理指标显示转基因株系在盐胁迫下MDA含量降低42.7%，ROS减少38.9%，SOD、POD、CAT酶活性分别提升至对照组的2.1、1.8、1.7倍，K+/Na+比例提高1.8-2.3倍。田间试验表明转基因大豆成熟期提前3-5天，株高、单株粒数、百粒重分别提高18.2%、12.7%、9.3%，产量损失率仅为8.61%（对照34.8%）。TL1株系已通过生物安全评价，进入商业化育种前期试验。研究揭示了ScHAL1通过调控Na+ influx和K+ retention维持离子平衡的分子机制，为作物耐盐基因工程提供新策略

　　### 研究背景与目标

盐害是全球农业生产面临的主要环境挑战之一，它对作物的生长和产量造成严重威胁。据联合国粮食及农业组织的数据显示，到2024年，全球超过十亿公顷的土地受到盐害影响，这直接导致了主要农作物的产量下降。随着全球气候变化和不合理灌溉等人类活动的加剧，盐害问题日益严重，因此提高作物的耐盐性成为保障农业可持续发展的关键。大豆（*Glycine max* L. Merr.）作为一种重要的蛋白质和油料作物，对盐害极为敏感，因此其产量和品质极易受到盐害的影响。尽管传统的作物育种方法在一定程度上取得了进展，但这些方法受限于盐害耐受性的多基因性和盐害耐受性种质资源的匮乏，进展缓慢。因此，遗传工程成为一种更具前景的手段，通过引入具有耐盐性的基因，提高作物在盐害环境中的生存能力。

在已知的耐盐基因中，酵母来源的*ScHAL1*基因被广泛研究。该基因在酵母中能够提高耐盐性，通过维持细胞内高浓度的钾离子（K?）和降低钠离子（Na?）浓度，从而减轻细胞内的钠离子毒性。此外，*ScHAL1*蛋白具有较高的保守性，其功能在酵母和植物中存在一定的相似性。这一特性使其成为一种潜在的候选基因，可用于开发耐盐性转基因大豆。然而，目前关于*ScHAL1*基因在大豆中的研究还处于实验室阶段，尚未进行实际田间试验。因此，本研究的目标是通过*Agrobacterium tumefaciens*介导的转化技术，将*ScHAL1*基因引入大豆，实现其在田间环境中的稳定表达，并评估其对大豆耐盐性和产量的影响。

### 实验方法与转基因大豆的生成

本研究采用*Agrobacterium tumefaciens*介导的转化技术，将*ScHAL1*基因与*bar*基因（一种筛选标记基因）同时导入大豆品种“Williams 82”中。*ScHAL1*基因来源于酵母，而*bar*基因则用于筛选转基因植株。为了确保*ScHAL1*基因在大豆中的稳定表达，研究人员使用了二元载体*pCAMBIA3301-HAL1*，该载体包含*ScHAL1*基因和*bar*基因，分别由CaMV 35S启动子和NOS终止子调控。通过*Agrobacterium*介导的转化，研究人员获得了373株独立的转基因植株，并从中筛选出三个具有稳定耐盐性的转基因株系（TL1、TL2和TL3）。

为了验证*ScHAL1*和*bar*基因在转基因大豆中的整合、遗传和表达稳定性，研究人员采用了多种分子生物学方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、Southern blotting、逆转录PCR（RT-PCR）、定量逆转录PCR（qRT-PCR）、Western blotting和酶联免疫吸附测定（ELISA）。这些方法不仅用于检测转基因基因的表达情况，还用于确认其在多个世代（T4、T5和T6）中的遗传稳定性。结果表明，*ScHAL1*和*bar*基因在转基因大豆中能够稳定整合、遗传并表达，为后续的耐盐性评估提供了基础。

### 耐盐性评估与生理指标分析

在实验室、温室和田间条件下，研究人员对转基因株系TL1、TL2和TL3进行了耐盐性评估。结果表明，在300?mM NaCl胁迫下，这些株系的发芽率（GP）和根长显著高于非转基因对照（NT）植株。此外，盐害指数（STI）也显示转基因株系具有更高的耐盐性，这表明它们在盐害环境中的生长能力和存活率得到了显著提升。

为了进一步了解*ScHAL1*基因在耐盐性中的作用机制，研究人员对转基因大豆的生理指标进行了分析。包括丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，以及脯氨酸（PRO）含量。结果显示，在盐害胁迫下，转基因株系的MDA含量显著低于NT植株，这表明细胞膜脂质过氧化和渗透性损伤得到了有效控制。同时，ROS水平的降低和抗氧化酶活性的提高，进一步说明*ScHAL1*基因在减轻氧化应激方面的积极作用。

此外，转基因株系中的PRO含量显著高于NT植株，这表明PRO在维持细胞内的渗透平衡和抗氧化作用方面发挥了重要作用。PRO不仅能够帮助细胞保持水分，还能稳定蛋白质和细胞膜结构，从而提高植物的耐盐能力。在盐害胁迫下，转基因株系的K?/Na?比值显著高于NT植株，这表明*ScHAL1*基因通过调控钠离子和钾离子的动态平衡，提高了细胞内的离子稳定性，从而减少了钠离子对细胞功能的干扰。

### 农艺性状评估与产量表现

在田间试验中，研究人员对转基因株系的农艺性状进行了评估，包括成熟期、开花期、株高、每株粒数、100粒重和每株产量。结果显示，在盐害胁迫下，转基因株系的这些农艺性状均显著优于NT植株。例如，株高、每株粒数和100粒重的增加，以及每株产量的提高，表明*ScHAL1*基因的引入不仅提高了大豆的耐盐性，还改善了其生长和产量表现。

值得注意的是，在盐害胁迫下，转基因株系的产量损失仅为8.61%，而NT植株的产量损失高达34.8%。这一结果表明，*ScHAL1*基因的过表达能够有效缓解盐害对大豆产量的影响，为提高大豆在盐害环境中的生产能力提供了重要依据。

### 研究意义与应用前景

本研究首次在田间环境下验证了*ScHAL1*基因对大豆耐盐性的提升效果，为耐盐性转基因大豆的开发提供了重要的实验支持。TL1株系，作为表现最佳的转基因株系，已被批准进入预生产田间试验的生物安全性评估阶段，这一进展标志着转基因大豆在实际农业生产中的应用迈出了关键一步。

从更广泛的角度来看，本研究展示了*ScHAL1*基因在不同作物中的应用潜力。通过引入*ScHAL1*基因，可以显著提高作物在盐害环境中的生存能力和产量。这种基因工程策略不仅适用于大豆，还可以推广到其他作物，如水稻、棉花和番茄等，从而在多种作物中实现耐盐性的提升。

然而，尽管本研究取得了重要进展，仍存在一些局限性。例如，转基因大豆的耐盐性评估主要在控制条件下进行，尚未在不同地区和自然环境条件下进行大规模田间试验。此外，*ScHAL1*基因与大豆自身离子转运蛋白之间的分子相互作用机制尚不明确，这可能影响其在实际应用中的效果。因此，未来的研究需要进一步探讨这些基因的分子网络及其与内源性应激信号通路的相互作用，以确保其在田间环境中的稳定性和安全性。

### 研究方法与技术细节

在本研究中，研究人员采用了多种分子生物学技术来验证*ScHAL1*基因在转基因大豆中的整合、表达和遗传稳定性。首先，通过PCR分析，确认了*ScHAL1*和*bar*基因在T4、T5和T6世代中的存在。随后，使用Southern blotting进一步验证了基因在大豆基因组中的整合情况，结果显示*ScHAL1*和*bar*基因在转基因大豆中能够稳定遗传。

为了研究*ScHAL1*基因的表达情况，研究人员采用了RT-PCR和qRT-PCR技术。这些技术不仅能够检测基因的表达水平，还能通过定量分析，比较不同世代和不同株系之间的表达差异。结果显示，在盐害胁迫下，*ScHAL1*基因在转基因大豆中的表达水平显著高于NT植株，这表明其在耐盐性调控中的重要作用。

此外，Western blotting和ELISA分析进一步确认了*ScHAL1*蛋白在转基因大豆中的稳定表达。这些方法能够检测蛋白质的丰度和活性，为研究基因表达产物的功能提供了直接证据。结果表明，转基因大豆中的*ScHAL1*蛋白在盐害胁迫下能够维持较高的表达水平，从而发挥其在细胞内离子平衡中的作用。

在生理指标分析中，研究人员使用了多种检测方法，包括MDA和PRO含量的测定、ROS水平的检测以及抗氧化酶活性的分析。这些指标能够全面反映植物在盐害环境中的生理响应和适应能力。例如，MDA含量的降低和PRO含量的增加，表明转基因大豆在盐害胁迫下能够有效减少细胞膜损伤和维持渗透平衡。

在田间试验中，研究人员采用了完全随机设计，以确保实验结果的可靠性。通过比较不同世代和不同株系的农艺性状，研究人员发现转基因株系在盐害胁迫下的生长表现优于NT植株。这一结果不仅验证了*ScHAL1*基因的耐盐性提升效果，还为其在实际农业生产中的应用提供了依据。

### 研究结论与未来展望

综上所述，本研究成功地将*ScHAL1*基因导入大豆，并验证了其在多个世代中的稳定表达和遗传传递。转基因株系TL1、TL2和TL3在盐害胁迫下表现出显著的耐盐性和农艺性状改善，这表明*ScHAL1*基因在提高大豆耐盐性方面具有重要潜力。通过维持细胞内的K?/Na?比值，*ScHAL1*基因能够有效减少钠离子对细胞的毒性，从而提高大豆在盐害环境中的生长能力和产量。

尽管本研究取得了重要进展，但未来仍需进一步探索*ScHAL1*基因与内源性离子转运蛋白之间的相互作用机制，以及其在不同环境条件下的表现。此外，还需要进行多地点的田间试验，以验证转基因大豆在自然环境中的适应性和稳定性。同时，对转基因大豆的生态安全性和长期影响也需要进行深入研究，以确保其在实际应用中的安全性。

本研究不仅为提高大豆的耐盐性提供了新的策略，也为其他作物的耐盐性改良提供了参考。随着转基因技术的不断发展，未来有望在更多作物中应用类似的方法，以应对全球日益严重的盐害问题。这将有助于提高作物的产量和质量，保障全球粮食安全。