利用部分雄性不育技术开发高效的杂交水稻种子生产系统

《Plant Biotechnology Journal》：Developing an Efficient System for Hybrid Rice Seed Production Using Partial Male Sterility

高效杂交水稻种子生产依赖于雄性不育系统，本研究鉴定了GTrD5和GTrD9两个关键基因。通过CRISPR/Cas9技术构建gtrd5flo5和gtrd9flo5双突变体，结合 opaque endosperm标记，实现自交与杂交种子的可视化区分，使杂交种子产量显著提升至62.6%，同时克服环境依赖性。

　　在水稻种植中，提高杂交种子的生产效率是实现高产的重要手段。由于水稻是自花授粉作物，其种子繁殖过程存在一定的自我繁殖风险，这限制了杂交种子的产量和纯度。为了解决这一问题，科学家们一直在探索更加高效、稳定和经济的杂交育种方法。最近，一项基于基因编辑技术的研究揭示了两个关键基因——*GTrD5* 和 *GTrD9*——在水稻雄性配子传递中的重要性，并进一步开发出一种创新的两系杂交系统，能够有效区分杂交种子和自花授粉种子，从而提升杂交种子的产量和质量。

### 一、研究背景与意义

水稻作为全球一半以上人口的主食来源，其产量的提升对于保障粮食安全至关重要。随着世界人口的持续增长，水稻种植面临着土地、水资源以及劳动力短缺等多重挑战。因此，开发高产、优质、抗逆的水稻品种成为农业研究的重要目标。杂交水稻技术因其显著的增产效果而受到广泛关注，但其推广受到杂交种子生产成本高和过程复杂等问题的限制。传统的三系杂交系统依赖于细胞质雄性不育（CMS）和恢复系，需要复杂的田间管理和繁多的基因操作，增加了生产难度和经济负担。相比之下，两系杂交系统通过基因雄性不育（GMS）减少了对恢复系的依赖，但其仍然受到环境因素（如光周期和温度）的影响，导致杂交种子的生产不稳定。

为克服这些局限，研究者致力于开发一种更稳定、更高效的杂交水稻育种系统。本研究中，科学家们通过基因编辑技术，找到了两个对雄性配子传递至关重要的基因——*GTrD5* 和 *GTrD9*。这两个基因的突变会导致部分雄性不育，从而降低自花授粉率。结合这一特性，研究人员还引入了一个可识别的标记基因——*FLO5*，该基因的缺陷会导致种子胚乳呈现不透明的特征，使得杂交种子和自花授粉种子可以通过胚乳形态进行区分。这种组合不仅提高了杂交种子的生产效率，还为杂交育种提供了更简便、更环保的解决方案。

### 二、关键基因的鉴定与表型分析

研究人员首先通过筛选107条T-DNA插入系，发现了628个与晚期花粉偏好相关的基因。在这些基因中，有20条未遵循孟德尔遗传比例，表明它们可能与雄性不育相关。进一步分析发现，*GTrD5* 和 *GTrD9* 是这两个基因中的关键成员。*GTrD5* 编码一种包含保守Sac结构域和预测的跨膜螺旋的蛋白质，而 *GTrD9* 编码一种包含RSN1_TM和PHM7结构域的蛋白质。这些基因的突变导致雄性不育，但并未影响植物的营养生长和生殖发育。

为了验证这些基因是否影响雄性或雌性配子的传递，研究人员进行了双向杂交实验。结果显示，当*GTrD/gtrd*植株作为父本与野生型植株杂交时，所有后代均为野生型；而当*GTrD/gtrd*植株作为母本与野生型植株杂交时，后代呈现出1:1的分离比例。这一结果表明，*GTrD5* 和 *GTrD9* 主要影响雄性配子的传递过程。进一步的实验表明，当这些基因被CRISPR/Cas9编辑为纯合突变体（*gtrd5-1* 和 *gtrd9-1*）时，它们表现出部分雄性不育的表型，但仍然能够进行一定程度的授粉。其中，*gtrd5-1* 的雄性不育率约为15%，而 *gtrd9-1* 则高达28%。这些数据表明，*GTrD5* 和 *GTrD9* 在雄性配子的生长过程中起着至关重要的作用。

### 三、两系杂交系统的构建与验证

在确定了这两个关键基因后，研究人员进一步结合了*FLO5*基因，以构建一个能够有效区分杂交种子和自花授粉种子的两系杂交系统。*FLO5*基因的突变会导致胚乳呈现不透明的特征，从而在视觉上与正常胚乳形成明显差异。通过CRISPR/Cas9技术，研究人员成功构建了* gtrd5flo5* 和 *gtrd9flo5* 双突变体，这些突变体在自花授粉时产生不透明的种子，而在与正常花粉杂交时则生成透明的杂交种子。这一系统不仅能够维持母本的遗传特性，还能通过杂交产生高产的杂交种子。

为了验证该系统的有效性，研究人员将* gtrd5flo5* 和 *gtrd9flo5* 作为母本，与黄金稻（Golden Rice）进行杂交实验。结果显示，使用这些双突变体作为母本后，杂交种子的比例显著提高，而自花授粉种子的比例大幅下降。这表明，该系统能够有效减少自花授粉，提高杂交种子的产量。此外，通过显微镜观察，研究人员发现* gtrd5flo5* 和 *gtrd9flo5* 的花粉管在进入胚囊时存在生长缺陷，而黄金稻的花粉管则能够正常延伸至胚囊，完成授粉过程。这一发现进一步验证了该系统的可行性。

### 四、系统优势与应用前景

该两系杂交系统相比传统的CMS和PTGMS系统具有显著优势。首先，它不依赖于环境因素，因此在气候变化和极端天气条件下仍能保持稳定的杂交种子产量。其次，该系统不需要复杂的田间管理，减少了人工操作和成本。此外，该系统采用非转基因技术，使得杂交种子和自花授粉种子都为非转基因，这在商业化推广中具有明显优势，避免了转基因种子可能面临的监管问题。

在田间试验中，研究人员发现，当* gtrd5flo5* 和 *gtrd9flo5* 作为母本与黄金稻进行杂交时，杂交种子的设置率可达60%，而自花授粉种子的比例则非常低。为了进一步提高杂交种子的产量，研究团队建议优化授粉条件，如提高花粉供体密度、同步母本和供体的开花时间，并控制田间环境因素（如温度、湿度和风速）。这些措施有助于提高杂交种子的产量和纯度，从而提升整个杂交育种系统的效率。

### 五、技术原理与未来发展方向

该两系杂交系统的核心在于利用*GTrD5* 和 *GTrD9* 基因的突变来实现部分雄性不育，同时结合*FLO5*基因的标记特性来区分杂交种子和自花授粉种子。*GTrD5* 和 *GTrD9* 基因的突变导致花粉管在进入胚囊前停止生长，从而减少了自花授粉的可能性。这种机制使得母本可以通过自花授粉维持其遗传稳定性，同时通过与供体的杂交产生高产的杂交种子。

此外，研究人员还利用PCR和基因测序技术对突变体进行了基因型鉴定，确保其遗传特性符合预期。在田间实验中，研究人员发现，虽然突变体的授粉能力较弱，但通过人工授粉可以显著提高杂交种子的产量。因此，未来可以进一步优化授粉技术，提高授粉效率，从而实现更高比例的杂交种子生产。

### 六、结论与展望

本研究成功开发了一种基于*GTrD5* 和 *GTrD9* 基因突变的两系杂交系统，该系统不仅能够有效减少自花授粉，提高杂交种子的产量，还具有不依赖环境因素、操作简便和商业化前景广阔等优势。这一技术为杂交水稻的高效生产提供了新的思路，有望在未来广泛应用。同时，该系统还可以与其他标记基因（如种子颜色、大小或抗除草剂基因）结合，进一步提升其在实际应用中的灵活性和实用性。随着基因编辑技术的不断发展，未来有望开发出更多类似的基因组合，为水稻育种提供更多选择和优化空间。