安罗格列醇通过抑制PI3K/AKT1/RRM2介导的氧化应激损伤，缓解2型糖尿病肾病

《Journal of Advanced Research》：Andrographolide alleviates type 2 diabetic nephropathy through suppressing PI3K/AKT1/RRM2-triggered oxeiptosis

磷酸化胰岛素受体底物1（IRS-1）酪氨酸612磷酸化水平降低，丝氨酸307磷酸化水平升高，AND通过抑制PI3K/AKT1通路和RRM2表达逆转氧化应激介导的oxeiptosis，改善T2DN代谢紊乱和肾纤维化。

　　在当今全球范围内，糖尿病已成为一个严重的健康负担，尤其是2型糖尿病（T2DM）及其并发症，如糖尿病性肾病（T2DN），引起了科学界的广泛关注。随着糖尿病发病率的持续上升，以及现有治疗手段在安全性和经济性方面的局限性，寻找更安全且成本效益更高的补充剂成为当前研究的重点。在此背景下，研究团队通过整合网络药理学和初步筛选，发现andrographolide（AND）可能具有治疗T2DN的潜力。本研究通过建立犬类T2DN模型，深入探讨了AND在改善T2DN相关代谢紊乱和肾病理方面的效果，并揭示了其作用机制。

T2DN是一种常见的微血管并发症，主要特征包括代谢功能障碍（如高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症和葡萄糖尿）以及肾脏病理变化（如肾小球滤过能力下降和纤维化）。在本研究中，给予AND后，这些病理特征得到了显著改善。通过整合转录组分析，研究团队揭示了T2DN进展与PI3K/AKT1信号通路激活、RRM2上调和以过氧化氢为主的活性氧（ROS）反应之间存在机制性关联。随后的实验验证进一步确认了ROS依赖性的oxeiptosis（一种非caspase依赖性的细胞死亡途径）通过PI3K/AKT1/RRM2轴的超激活诱导。研究还发现，T2DN通过一个自我放大的循环加剧肾损伤：高血糖刺激的ROS过量产生驱动PI3K/AKT1介导的RRM2上调，而RRM2又促进oxeiptosis。值得注意的是，AND通过抑制PI3K/AKT1/RRM2信号通路的过度激活以及ROS-oxeiptosis的相互作用，中断了这一病理性级联反应，从而展现出治疗潜力。这些发现不仅为针对PI3K/AKT1/RRM2-oxeiptosis轴的临床策略提供了转化指导，也为基于AND的治疗药物开发提供了机制依据。

当前治疗T2DN的策略仍然受到副作用和经济成本的限制，迫切需要开发新的疗法以优化安全性和疗效。传统中药因其多成分、多靶点和整体调节特性，近年来受到了广泛关注。Andrographis paniculata（AP）在T2DM治疗中的潜在作用已被部分揭示，其甲醇提取物在糖尿病大鼠模型中显示出免疫刺激和神经保护特性。此外，其水提取物在临床人群和肥胖糖尿病小鼠中能有效降低空腹和餐后高血糖及体重指数。同时，AP被证明能通过增强胰岛素敏感性、上调糖酵解酶活性和增加GLUT4蛋白表达，积极影响葡萄糖代谢和利用。尽管已有研究揭示了AP在治疗T2DM中的机制，但其在T2DN中的肾保护潜力尚未充分探索。此外，关于AP中具体活性成分的治疗作用及这些成分在T2DN中的靶点和分子机制，仍存在较大的知识空白。填补这些空白有助于深入理解T2DN的发病机制，并推动其管理策略的改进。

oxeiptosis是一种非炎症性、非caspase依赖性的细胞死亡机制，其主要特征是ROS驱动的细胞死亡。在oxeiptosis过程中，KEAP1、PGAM5和AIFM1分别扮演不同的关键角色。KEAP1作为ROS传感器，能够检测细胞内氧化应激水平。当ROS浓度达到有害阈值时，KEAP1会从PGAM5中解离，从而激活PGAM5。PGAM5随后会移位到线粒体并与AIFM1结合，从而启动细胞死亡。因此，KEAP1不仅是一个调节因子，还作为oxeiptosis信号的启动者。PGAM5作为磷酸酶，通过去磷酸化AIFM1的特定残基（尤其是Serine 116）执行关键步骤，从而促进细胞死亡。PGAM5在信号通路中起到桥梁作用，连接KEAP1和AIFM1。AIFM1在细胞质和线粒体中都有存在，既是oxeiptosis的标志物，也是关键调控因子。AIFM1去磷酸化形式（尤其是S116位点）代表了oxeiptosis激活的标志。其激活直接执行终端细胞死亡信号，使AIFM1成为这一过程的最终效应器。

ROS在T2DM及其相关肾病的发病机制中扮演了关键角色。已有研究表明，ROS水平升高和由此引发的氧化应激是导致胰岛素抵抗（IR）和T2DM进展的重要因素。近期研究进一步揭示了高血糖通过多个分子途径（如蛋白激酶C（PKC）激活、晚期糖基化终产物（AGEs）形成、多醇通路流量增加、葡萄糖自氧化和己糖胺通路过度激活）引发ROS过量生成，从而加剧氧化应激。ROS作为oxeiptosis的重要致病因子，其水平升高与T2DN的病理变化密切相关。因此，有必要探讨T2DN中的ROS水平是否与oxeiptosis有关。揭示oxeiptosis与T2DN之间的关系，将为T2DN的发病机制提供关键见解，并为相关治疗策略的理论基础奠定基础。

为了进一步验证这一理论，研究团队建立了犬类T2DN模型，以评估AND在治疗T2DN中的疗效。该模型通过高脂肪和高碳水化合物饮食及链脲佐菌素（STZ）诱导，展现出典型的代谢功能障碍（如高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症和葡萄糖尿）和肾病理特征（如肾小球滤过能力下降、纤维化重塑）。给予AND后，这些病理特征得到了显著改善。整合转录组分析揭示了T2DN进展与PI3K/AKT1信号通路激活、RRM2上调和以过氧化氢为主的ROS反应之间存在机制性联系。研究确认了高血糖通过PI3K/AKT1信号通路上调RRM2，从而触发oxeiptosis。显著的是，AND对PI3K/AKT1通路和RRM2均表现出双重抑制效应，能够有效逆转oxeiptosis过程，这可能是其在T2DN治疗中发挥作用的潜在机制。这些发现表明AND可能是一种针对PI3K/AKT1/RRM2-oxeiptosis轴的新颖多靶点补充剂，为T2DN的管理提供了机制基础。

在实验设计中，研究团队利用网络药理学和生物信息学方法，识别了AP中具有潜在治疗效果的活性成分。随后，通过分子对接技术初步筛选了这些活性成分与T2DN相关靶点的结合。此外，研究团队还利用SwissADME和SwissTargetPrediction等工具，预测了AP靶基因的药代动力学。同时，T2DN相关靶点通过Genecards和OMIM数据库获得。通过Venny分析，研究团队识别了AP与T2DN之间的交集基因，并利用STRING数据库构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。进一步的京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析揭示了PI3K/AKT1信号通路、氧化应激反应、活性氧代谢过程、细胞氧化应激反应和超氧化物代谢过程的富集，这与之前的网络药理学结果一致，进一步确认了这些通路在AND治疗T2DN中的作用。

在实验验证部分，研究团队采用了一系列实验技术，包括表面等离子体共振（SPR）检测、分子动力学（MD）模拟、组织病理学分析、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IFA）染色等。这些实验技术不仅用于评估AND的治疗效果，还用于确认其对PI3K/AKT1信号通路和RRM2的调控作用。例如，SPR检测显示AND与AKT1具有强效的结合亲和力（Kd = 4.74e-06 M），表明AKT1是AND的靶蛋白。MD模拟进一步证明了AND与AKT1结合的稳定性。此外，通过组织病理学分析，研究团队确认了AND在改善肾小球滤过功能和肾病理特征方面的效果。具体而言，AND显著改善了肾小球滤过能力，减少了纤维化重塑，并通过调控PI3K/AKT1信号通路和RRM2，逆转了oxeiptosis过程。

研究还发现，AND能够通过调控ROS水平和氧化应激反应，改善T2DN相关的代谢紊乱和肾功能。通过分析ROS和H2O2的水平，研究团队验证了AND对ROS积累的抑制作用，以及其对PI3K/AKT1信号通路和RRM2的调控。此外，研究团队还评估了AND在不同剂量下的治疗效果，发现其对T2DN的治疗效果具有剂量依赖性。这些结果表明，AND能够通过抑制ROS-oxeiptosis之间的相互作用，发挥其治疗作用。

综上所述，本研究通过建立犬类T2DN模型，揭示了AND在治疗T2DN中的潜在作用。AND通过抑制PI3K/AKT1/RRM2信号通路的过度激活和ROS-oxeiptosis的相互作用，有效逆转了T2DN相关的代谢紊乱和肾病理特征。这些发现不仅为T2DN的治疗策略提供了新的思路，还为基于AND的药物开发提供了理论依据。同时，研究团队还探讨了AND与传统药物（如二甲双胍）联合治疗在T2DN中的协同效应，结果显示AND与MET的联合治疗在改善HOMA-IR和血糖水平方面表现出显著优势，表明其在T2DN治疗中的潜在价值。

然而，研究也指出了一些局限性。例如，AND的药代动力学特性（如低溶解度和较差的口服吸收）限制了其临床应用，需要进一步开发先进的递送策略以提高其生物利用度。此外，尽管本研究主要聚焦于肾组织，但未来的研究应探讨这一信号通路在其他糖尿病相关组织（如视网膜和心血管系统）中的作用。同时，AND与MET的协同作用机制仍有待深入研究，以进一步揭示其在T2DN治疗中的潜在价值。通过解决这些局限性，研究团队希望为T2DN的治疗策略提供更全面的见解，并推动相关药物的开发。