TMEM166通过负调控未折叠蛋白反应影响肝癌细胞生长与索拉非尼耐药性的机制研究

《Cell Death & Disease》：TMEM166 negatively regulates unfolded protein response to affect hepatocellular carcinoma cell growth and sorafenib resistance

本研究揭示了TMEM166通过调控内质网应激通路影响肝癌进展的新机制。研究人员发现TMEM166缺失会促进ACSL3降解，增强脂肪酸β-氧化(FAO)和线粒体ATP生成，通过AMPK-mTOR轴加速蛋白质合成，从而诱导亚致死性ER应激并激活UPR。该研究首次阐明TMEM166-UPR轴在肝癌增殖和索拉非尼耐药中的关键作用，为肝癌靶向治疗提供了新策略。

　　

在肝癌治疗领域，索拉非尼作为一线靶向药物却面临着耐药性的严峻挑战。与此同时，内质网应激和未折叠蛋白反应(UPR)在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注。作为一种重要的细胞器，内质网负责约三分之一蛋白质的合成与折叠，当功能受损时会引起未折叠蛋白积累，激活UPR这一适应性反应机制。然而，UPR在肝癌中的具体调控网络仍有待深入探索。

跨膜蛋白166(TMEM166)是一个定位于内质网的膜蛋白，既往研究表明其在多种癌症组织中表达下调，并通过诱导自噬和凋亡发挥抗癌作用。但TMEM166在肝细胞癌(HCC)中的具体功能机制尚不明确。尤其值得注意的是，作为内质网定位蛋白，TMEM166是否参与UPR调控进而影响肝癌进展，这一科学问题值得深入研究。

为了回答这一问题，研究团队首先通过临床样本分析发现，TMEM166在肝癌组织中表达显著降低，且与患者不良预后相关。有趣的是，TMEM166表达水平与UPR关键转录因子ATF4、ATF6和XBP1s的活性呈负相关，提示TMEM166可能负向调控UPR。

研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了TMEM166基因敲除(KO)的Huh7细胞株，发现TMEM166缺失确实能够显著增强UPR活性。在静息状态下，TMEM166-KO细胞就表现出IRE1磷酸化、XBP1s剪接、PERK活化、ATF4表达上调以及ATF6核转位等UPR标志性事件。而用衣霉素(Tm)和毒胡萝卜素(Tg)诱导内质网应激后，这种激活效应更为明显。

机制探索方面，研究团队发现TMEM166缺失会导致内质网形态发生改变，蛋白质聚集增加。通过转录组测序和SUnSET(表面传感胚胎翻译) assay检测，证实TMEM166-KO细胞蛋白质合成速率显著加快。进一步研究发现，这种效应是通过AMPK-mTOR信号轴实现的——TMEM166缺失导致AMPK磷酸化水平降低，mTOR下游靶点S6K磷酸化增强。

尤为重要的是，研究团队通过免疫共沉淀-质谱分析发现TMEM166与ACSL3(长链脂肪酰辅酶A连接酶3)存在直接相互作用。TMEM166能够稳定ACSL3蛋白，而TMEM166缺失则加速ACSL3降解。ACSL3是脂质代谢的关键酶，其主要功能是促进脂质在脂滴中的储存。TMEM166-KO细胞中ACSL3表达下调导致甘油三酯含量降低，脂肪酸β-氧化(FAO)增强，进而促进线粒体呼吸和ATP生成。

在功能层面，TMEM166缺失显著促进肝癌细胞增殖，表现为细胞活力增强、Ki67阳性率升高和克隆形成能力增强。通过药理学和遗传学手段干预UPR不同分支，研究人员发现PERK-ATF4轴在促进细胞增殖中起关键作用，而IRE1和ATF6激活则主要介导索拉非尼耐药。

临床相关性分析显示，TMEM166低表达与索非尼耐药显著相关。TMEM166过表达能够增强BEL-7402细胞对索拉非尼的敏感性，而TMEM166缺失则诱导Huh7细胞产生耐药性。用内质网应激抑制剂TUDCA处理可逆转TMEM166-KO细胞的耐药表型，证实UPR激活在其中的重要作用。

本研究首次阐明了TMEM166通过ACSL3-FAO-ATP-mTOR信号轴负调控UPR的全新机制。在TMEM166缺失的情况下，ACSL3稳定性降低导致脂质储存减少，脂肪酸β-氧化增强，线粒体ATP生成增加，进而通过抑制AMPK激活mTOR信号，促进蛋白质合成并诱导内质网应激，最终激活UPR。在肝癌细胞中，TMEM166缺失通过PERK-ATF4轴促进细胞增殖，并通过IRE1和ATF6激活赋予索非尼耐药性。

该研究的技术方法主要包括：利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞系，免疫共沉淀和质谱分析鉴定相互作用蛋白，透射电子显微镜观察细胞超微结构，Seahorse能量代谢分析仪检测线粒体呼吸功能，免疫组织化学分析临床组织样本（样本来源于山东医学高等专科学校附属临沂市人民医院），以及细胞活力检测、克隆形成实验等功能学验证。

这项发表于《Cell Death and Disease》的研究不仅深化了对TMEM166生物学功能的认识，更重要的是揭示了其在UPR调控中的新角色，为理解肝癌发生发展和耐药机制提供了新的理论依据。研究结果表明，TMEM166可能成为肝癌预后判断和治疗反应预测的生物标志物，针对TMEM166-UPR轴的干预策略有望为肝癌治疗提供新的思路。特别是将TMEM166表达调控与索非尼等靶向药物联合应用，可能成为克服肝癌耐药性的有效策略。该研究为开发基于TMEM166的基因治疗方法奠定了坚实基础，对推进肝癌精准治疗具有重要意义。