CK2调控HERPUD1稳定性介导棕榈酸诱导的未折叠蛋白反应促进三阴性乳腺癌恶性进展

《Cell Death & Disease》：HERPUD1 mediates palmitic acid-induced UPR sustaining TNBC aggressiveness and is destabilized by CK2 pharmacological inhibition

本研究聚焦三阴性乳腺癌(TNBC)治疗困境，探索内质网应激蛋白HERPUD1在肥胖相关脂质应激下的调控机制。团队发现HERPUD1在乳腺癌组织显著高表达，并通过CK2介导的Ser59磷酸化稳定蛋白结构，促进TNBC细胞增殖、迁移及化疗耐药。利用基因敲除、3D肿瘤球模型等技术，证实抑制CK2可 destabilize HERPUD1并增强多柔比星(DOX)敏感性，为靶向脂质应激通路的新型疗法提供理论依据。

　　

在乳腺癌的众多亚型中，三阴性乳腺癌（TNBC）因其缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达，成为最具侵袭性且治疗选择最有限的类型。肥胖作为明确的乳腺癌风险因素，其机制与循环中高水平的饱和脂肪酸——特别是棕榈酸（PA）——密切相关。棕榈酸可诱导内质网（ER）应激，激活未折叠蛋白反应（UPR），而慢性的UPR激活在癌细胞中会促进存活、侵袭和 therapy resistance。然而，将肥胖相关的脂质应激与TNBC恶性进展联系起来的精确分子机制仍不清晰。HERPUD1是一种内质网应激响应蛋白，是UPR的早期标志物，参与ER-associated degradation (ERAD)，但其在TNBC，特别是在脂质应激背景下的具体功能，尚属未知。

为了解决这一知识空白，由Laura Hernández-Torres和Patricia V. Burgos领导的研究团队在《Cell Death and Disease》上发表了他们的研究成果。他们旨在揭示HERPUD1是否在连接脂质应激与TNBC恶性进展中发挥关键作用，并探索其调控机制和 therapeutic potential。

研究人员首先通过免疫组织化学和免疫荧光分析了乳腺癌组织微阵列，发现与 non-malignant breast tissue (NBT) 相比，HERPUD1在乳腺癌组织（包括Luminal A型和TNBC）中表达显著升高，且主要定位于肿瘤上皮细胞和肿瘤浸润免疫细胞（CD45⁺）。这提示HERPUD1可能参与肿瘤 progression 和 tumor microenvironment 的调节。

为了模拟生理性应激，研究团队使用棕榈酸（PA）处理不同乳腺癌细胞系。有趣的是，只有在高度侵袭性的TNBC细胞系MDA-MB-231中，PA能特异性上调HERPUD1以及UPR关键转录因子XBP1s和ATF4的表达。而使用化学应激诱导剂毒胡萝卜素（TG）处理时，所有测试的乳腺癌细胞系均表现出HERPUD1的上调。这表明HERPUD1对PA的响应具有细胞类型特异性，可能与TNBC独特的脂质 handling capacity 有关。

为了探究HERPUD1的功能，研究人员在MDA-MB-231细胞中建立了稳定敲低（KD）和敲除（KO）模型。功能实验表明，HERPUD1缺失显著抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在分子水平上，HERPUD1敲低导致间质标志物Snail表达下降，而上皮标志物E-cadherin和ZO-1表达上升，表明HERPUD1有助于维持TNBC细胞的 mesenchymal phenotype。更重要的是，HERPUD1的缺失增强了TNBC细胞对化疗药物 doxorubicin (DOX) 的敏感性，表现为细胞存活率下降、caspase-3剪切和PARP1 cleavage 增加。在更接近体内肿瘤结构的3D肿瘤球模型中，HERPUD1敲低同样导致肿瘤球面积减小、侵袭胶原基质的能力下降，并且对DOX诱导的细胞死亡更敏感。

机制探讨方面，研究发现HERPUD1对UPR的调控取决于应激源的类型。在TG诱导的 proteotoxic stress 下，HERPUD1缺失反而增强了XBP1s和ATF4的水平，这与之前在其他模型中的报道一致。然而，在PA诱导的 lipid stress 下，HERPUD1的缺失则导致XBP1s和ATF4水平降低，同时细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-6和IL-8的分泌也减少。这揭示了HERPUD1在脂质应激特异性信号通路中的独特作用。

研究进一步深入揭示了调控HERPUD1稳定性的 post-translational modification。之前的研究提示HERPUD1的泛素样结构域（UBL domain）中Ser59位点的磷酸化可能稳定该蛋白。本研究通过 kinase screening，发现蛋白激酶CK2能磷酸化HERPUD1 UBL结构域，且对Ser59位点有特异性。实验证明，CK2的特异性抑制剂CX-4945 (Silmitasertib) 处理，能够降低TG和PA诱导的HERPUD1蛋白水平。表达磷酸模拟突变体HERPUD1-S59D则能增加细胞在DOX和CX-4945处理下的存活率，说明CK2介导的Ser59磷酸化对HERPUD1的稳定性和促存活功能至关重要。

最后，通过分子动力学模拟（Molecular dynamics simulations），研究人员提出了一个精妙的分子模型来解释磷酸化如何稳定HERPUD1。模拟结果显示，Ser59磷酸化后，其磷酸基团与邻近的Lys61的氨基形成稳定的离子键（盐桥），这使得UBL结构域的构象更加紧凑，并减少了Lys61的溶剂可及表面积（SASA）。由于Lys61是已知的泛素化位点，这种构象变化可能空间位阻了Lys61的泛素化过程，从而减缓了HERPUD1的蛋白酶体降解途径。

本研究综合利用了临床组织样本分析、细胞分子生物学、3D细胞模型、激酶活性筛选和分子动力学模拟等多种关键技术方法。研究涉及的乳腺癌组织样本来自智利Arturo López Pérez基金会（FALP）生物样本库。体外实验主要使用人乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231）。基因操作手段包括利用慢病毒shRNA进行基因敲低和利用CRISPR-Cas9系统进行基因敲除。功能分析涵盖2D细胞增殖（EdU掺入）、迁移（Transwell）实验和3D肿瘤球形成、侵袭及活力测定。分子机制研究涉及蛋白质印迹、ELISA、体外激酶测定、蛋白质纯化以及分子动力学模拟。

HERPUD1在乳腺癌组织中过表达并定位于肿瘤上皮和免疫细胞

研究人员通过免疫组织化学和免疫荧光分析乳腺癌组织微阵列，发现与 non-malignant breast tissue (NBT) 相比，HERPUD1在 luminal A 和 TNBC 活检组织中的表达水平显著更高，且主要位于细胞质。HERPUD1与细胞角蛋白（上皮细胞标志物）共定位，在BC组织的上皮细胞中显著增加。此外，在TNBC组织中，HERPUD1也在CD45⁺的免疫细胞中表达，且HERPUD1⁺/CD45⁺细胞群在TNBC中比在 luminal A 肿瘤中更为显著。

棕榈酸选择性上调MDA-MB-231细胞中的HERPUD1和XBP1s

用毒胡萝卜素（TG）处理多种乳腺癌细胞系，均能上调HERPUD1的mRNA和蛋白水平。然而，用棕榈酸（PA）处理时，只有高度侵袭性的TNBC细胞系MDA-MB-231特异性地上调了HERPUD1的mRNA和蛋白水平，同时XBP1s的mRNA和蛋白水平也升高。这表明PA诱导的HERPUD1上调具有细胞系特异性。

HERPUD1敲低抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移并逆转间质表型

在MDA-MB-231细胞中稳定敲低HERPUD1后，细胞增殖（EdU掺入实验）和迁移（Transwell实验）能力显著下降。此外，HERPUD1敲低导致间质标志物Snail蛋白水平降低，而上皮标志物E-cadherin和ZO-1蛋白水平升高，表明其参与维持间质表型。

HERPUD1敲低增强MDA-MB-231细胞对DOX的敏感性

HERPUD1敲低使MDA-MB-231细胞对 doxorubicin (DOX) 的敏感性增加，半数致死浓度（LD₅₀）降低，细胞存活率下降，凋亡标志物 cleaved caspase-3 和 cleaved PARP1 水平升高。而对 paclitaxel (PTX) 的敏感性无显著影响。

HERPUD1支持3D肿瘤球生长、侵袭和DOX敏感性

在3D肿瘤球模型中，HERPUD1敲低的MDA-MB-231细胞形成的肿瘤球面积更小，侵袭胶原基质的能力减弱，并且在DOX处理下表现出更低的细胞活力和更高的细胞死亡率。

HERPUD1是脂质应激诱导的UPR激活和促炎反应所必需的

HERPUD1敲除（KO）的MDA-MB-231细胞在TG处理后显示出更高的XBP1s和ATF4水平，但在PA处理后，XBP1s和ATF4水平则降低。此外，在基础条件下和PA应激下，HERPUD1 KO细胞分泌的IL-6和IL-8水平均显著低于野生型细胞。

CK2介导的磷酸化是HERPUD1稳定性和功能的关键调节因子

研究发现蛋白激酶CK2能磷酸化HERPUD1 UBL结构域的Ser59位点。CK2抑制剂CX-4945处理能降低TG和PA诱导的HERPUD1蛋白水平。表达磷酸模拟突变体S59D能稳定HERPUD1蛋白，并增加细胞在DOX和CX-4945处理下的存活率。

Ser59磷酸化通过限制Lys61泛素化调节HERPUD1稳定性

分子动力学模拟表明，Ser59磷酸化后，其磷酸基团与Lys61的侧链形成稳定的离子桥，减少了Lys61的溶剂可及性，这可能空间阻碍了Lys61的泛素化，从而稳定了HERPUD1蛋白。

本研究确立了HERPUD1作为连接肥胖相关脂质应激与TNBC恶性进展的关键分子节点。研究发现HERPUD1在乳腺癌中高表达，并在特定的TNBC细胞中响应棕榈酸而上调，促进细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）和化疗耐药。研究首次揭示CK2激酶通过磷酸化HERPUD1的Ser59位点来稳定该蛋白，并提出了磷酸化通过构象变化抑制邻近Lys61位点泛素化的分子模型。这些发现不仅深化了对UPR在癌症中 context-dependent 功能的理解，更重要的是，揭示了靶向CK2-HERPUD1轴可能是一种有前景的治疗策略，特别是对于由肥胖等因素驱动、具有特定脂质代谢特征的侵袭性TNBC。鉴于CK2抑制剂CX-4945已进入临床试验，本研究为其在TNBC治疗中的应用提供了新的理论依据和潜在的生物标志物（HERPUD1水平）。未来研究需要进一步验证HERPUD1在肿瘤免疫微环境中的作用以及其在体内模型中的治疗价值。