nERdy与nERdy+：基于网络分析和D4等变神经网络的内质网动态研究新方法

《Communications Biology》：nERdy: network analysis of endoplasmic reticulum dynamics

本研究针对内质网(ER)动态网络重建的挑战，开发了nERdy（图像处理流程）和nERdy+（D4等变神经网络）两种新方法，实现了对ER网络和连接点动态的精确提取。研究发现Atlastin(ATL)和Reticulon 4通过促进三联连接点动态和形成连续管状基质，在调节ER结构和动态中发挥新作用。该研究为理解ER形态发生蛋白功能提供了重要工具和见解。

　　

内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)作为细胞中最大的膜结合细胞器，从细胞核延伸到质膜，形成一个连续的膜网络。它不仅负责蛋白质合成、折叠和分选，还参与应激反应、Ca²⁺储存和脂质代谢等多种细胞功能。外周ER形成一个延伸的管状网络，与标记更密集的片状区域相连，其形态由片状诱导腔内间隔蛋白CLIMP-63和膜曲率诱导蛋白Reticulon 4的相对表达决定。

然而，理解外周管状网络与更密集管状基质中的动态ER行为面临重大挑战。现有重建方法对参数敏感或需要大量注释和深度学习训练。此外，ER动态分析因信噪比低和荧光强度在时空上高度可变而变得复杂。高速研究表明，一些通过衍射限制共聚焦显微镜识别的外周片状结构实际上是由密集的管状基质组成，这凸显了准确重建ER网络的必要性。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，Ashwin Samudre等人开发了两种新方法——nERdy（基于图像处理）和nERdy+（D4等变神经网络），用于精确提取和表示ER网络及连接点动态。研究发现Atlastin和Reticulon 4通过促进动态管状基质的形成和增强连接点动态，在调节ER结构和动态中发挥新作用。

研究人员采用的主要技术方法包括：开发了nERdy图像处理流程（含强度归一化、直方图均衡化、形态学操作和Jerman增强滤波）和nERdy+深度学习模型（D4等变编码器-解码器神经网络）；使用COS-7和HeLa细胞系进行高速共聚焦（25 Hz）和STED超分辨率时间序列成像（100帧）；通过骨架化和图论分析提取ER网络拓扑结构；利用连接组件算法分类连接点动态区域。样本来源于三个生物学重复，每个重复至少包含7个独立细胞区域。

数据集细节

研究通过高速共聚焦时间推移成像（25 Hz，100帧）分析COS-7和HeLa细胞中外周感兴趣区域(ROIs)。细胞转染了腔内ER报告基因ERmoxGFP以及Reticulon 4、CLIMP-63和mCherry标记的Atlastin。COS-7数据集包含117个时间序列，来自三个生物学重复，包括31个对照序列、26个双通道ERmoxGFP/Atlastin-mCherry序列，以及各31个ERmoxGFP/CLIMP-63和ERmoxGFP/Reticulon 4序列。

计算分析

管状ER结构分割

nERdy采用经典图像和图处理算法进行几何结构分析，提供计算效率高的解决方案。nERdy+是等变编码器-解码器神经网络，通过D4等变架构自然捕获数据对称性和变换，提高对扰动的鲁棒性。评估显示，nERdy和nERdy+在分割指标和图指标上均显著优于ERnet-v2。

nERdy+在共聚焦数据中表现最佳，Dice分数为0.96±0.003，F1分数为0.94±0.005，Jaccard指数为0.88±0.01。在STED数据中，nERdy+同样提供最佳度量值，表明其在分割ER结构方面的鲁棒性和有效性。

连接点动态提取

使用nERdy+的二进制分割输出进行骨架化，将输入对象表示为单像素宽的中心线，同时保持连接性。骨架化结构转换为图表示，节点基于三联分叉位置识别，对应于管状结构中的连接点。ER结构随时间的运动导致后续帧中出现动态连接点位置。

连接点区域分类

利用连接组件算法识别与每个连接点运动相关的区域，分为两类：孤立CC（仅包含一个参考连接点）和重叠CC（包含多个参考连接点）。这种分类有助于区分ER网络中的低运动和高运动区域。

Atlastin诱导密集管状网络

分析显示，Atlastin诱导ER中最短的管长，其次是Reticulon 4。统计分证明Atlastin与CLIMP-63以及Atlastin与Reticulon 4对在管长方面存在显著差异。这表明Atlastin和Reticulon 4在促进外周ER小管形成和连接它们的tripartite junctions方面发挥作用。

ER形态蛋白调节连接点动态

Reticulon 4和Atlastin在连接点数量和面积方面均显著增加重叠CC与孤立CC的比率，与对照和CLIMP-63表达细胞相比。CLIMP-63显示连接点数量和面积比率显著降低，表明连接点动态减少，但相对于对照条件有所增加。这些结果表明，Atlastin和Reticulon 4的表达显著促进ER连接点的动态、重叠相互作用。

ER形态蛋白调节管状基质动态

在共聚焦和STED数据中，Reticulon 4和Atlastin转染的COS-7细胞显示单个孤立和重叠CC面积显著增加。STED时间序列分析更清晰地显示，Reticulon 4转染的COS-7细胞的重叠CC定义了由动态ER小管组成的管状基质区域。这表明Reticulon 4和Atlastin通过增强连接点动态促进管状基质的形成。

研究结论表明，nERdy和nERdy+为ER网络分析提供了强大工具，能够准确捕捉ER动态和拓扑结构。研究发现Reticulon 4和Atlastin不仅促进外周ER网络的建立，还诱导更密集的管状基质的形成。这些效应归因于连接点动态的增加，因为Atlastin和Reticulon 4的表达增加了孤立CC的面积，反映了外周tripartite junctions的运动。STED超分辨率时间序列分析明确显示，重叠CC区域由动态小管组成，支持Reticulon 4和Atlastin在调节组织平滑ER网络表达中的作用。

该研究的重要意义在于开发了能够准确分析ER动态的创新计算方法，并揭示了ER形态发生蛋白在调节ER结构和动态中的新作用。这些发现不仅增进了对ER生物学的理解，而且为研究其他细胞器动态提供了方法论参考。研究结果表明，ER形态发生蛋白在ER的动态组织中发挥复杂作用，这对理解细胞器功能和相关疾病机制具有重要意义。