综述：关于亲水相互作用液相色谱法基础理解进展的最新信息

《Journal of Chromatography A》：An Update on the Progress in Fundamental Understanding of Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

HILIC近十年在吸附水层机制、保留因子与温度关系、离子相互作用及生物大分子分离中的应用取得显著进展，分子动力学模拟和相比例定量技术深化了水层结构认知，但保留机制量化、热力学关联及双保留行为仍存挑战。

　　近年来，随着分析技术的不断进步，亲水相互作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）在理论和方法学方面取得了显著发展。HILIC作为一种重要的分离技术，其应用范围已从最初的小分子极性化合物扩展到生物大分子领域，如单克隆抗体、抗体药物偶联物（ADCs）和mRNA等。这种扩展不仅反映了HILIC在分离能力上的提升，也说明了其在复杂生物样品分析中的潜力。与此同时，市场上出现了更多类型的HILIC柱和固定相，这些固定相通常具有惰性或低吸附性的表面，从而提高了对蛋白质和寡核苷酸等大分子的分离效率。

HILIC的核心在于其独特的保留机制，这些机制涉及多个因素，包括吸附水层、分子间的相互作用以及色谱柱的物理结构。早在1990年，Dr. Alpert在其开创性研究中提出了HILIC的保留机制，即通过亲水性分配作用实现对极性化合物的保留。这一理论奠定了HILIC研究的基础，但随着研究的深入，科学家们逐渐认识到，HILIC的保留机制远比最初设想的更为复杂。近年来，HILIC的研究不仅集中在验证亲水性分配作用，还开始探索其他可能的保留机制，例如化学位移、电荷相互作用等。这些研究的进展，使得我们能够更全面地理解HILIC在不同条件下的行为，并为实际应用提供更精确的指导。

HILIC的保留机制主要依赖于吸附水层的存在。这一水层被固定在极性固定相的表面，作为亲水性分配的“实际”固定相。吸附水层的结构和形成过程对于HILIC的保留行为至关重要。近年来，分子动力学模拟和定量相比测量等技术的应用，为研究吸附水层的形成、结构及其在色谱中的作用提供了新的视角。这些研究揭示了吸附水层的体积受多种因素的影响，包括固定相的性质、流动相中乙腈的含量、盐浓度以及温度。此外，吸附水层的物理和化学特性决定了极性化合物在色谱柱中的分布和保留行为。例如，某些极性化合物可能与固定相之间存在直接的相互作用，而另一些则可能通过吸附水层间接地与固定相发生作用。

在HILIC中，电荷相互作用对保留行为的影响尤为显著。尤其是对于离子化的分析物，电荷与固定相之间的静电相互作用可能在保留过程中起主导作用。例如，电荷排斥亲水相互作用色谱（Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography, ERLIC）利用强静电相互作用来实现对肽类物质的分离。静电相互作用的强度受流动相中盐浓度的影响，因此在HILIC条件下，研究如何调节静电相互作用对于优化分离效果具有重要意义。同时，HILIC与反相色谱（RPLC）在选择性方面存在显著差异。RPLC的选择性已被广泛研究，并在理论上得到了充分的理解。相比之下，HILIC的选择性仍主要依赖于选择性测试，缺乏对测试结果的深入机制分析。因此，进一步研究HILIC的基本原理，对于推动其在生物分析领域的应用至关重要。

HILIC的应用不仅限于分离极性化合物，还扩展到了其他复杂的生物分子。例如，在寡核苷酸分离方面，HILIC自诞生以来就显示出良好的应用前景，并在近年来对治疗性寡核苷酸的分析中展现出更高的分离效率。此外，HILIC在肽类物质分析中也扮演了重要角色，例如肽图分析。它还被用于完整蛋白质的分离，这些蛋白质的分离过程涉及复杂的分子间相互作用。然而，大多数关于肽和蛋白质的研究主要集中在特定的应用和色谱参数评估上，例如固定相的选择。虽然一些研究已经认识到HILIC中肽和蛋白质分离的保留机制具有复杂性，但很少有研究能够深入探讨具体的保留机制。因此，预测肽在HILIC中的保留时间仍然是一个重要的研究领域。

在HILIC的研究中，吸附水层的结构和形成机制一直是重点。早在2015年，已有研究通过氢同位素核磁共振（²H NMR）、前沿分析和库仑滴定等方法提供了支持吸附水层存在的证据。近年来，随着分子动力学模拟技术的发展，科学家们能够从分子层面更详细地研究吸附水层的形成和结构。这些研究不仅揭示了吸附水层的动态特性，还帮助我们理解其在色谱过程中的作用。例如，吸附水层的体积和结构可能会影响极性化合物在固定相和流动相之间的分配，从而改变其保留行为。因此，研究吸附水层的形成和变化对于优化HILIC的分离效果具有重要意义。

在HILIC的保留机制方面，近年来的研究主要集中在揭示其复杂的分子间相互作用。这些研究不仅包括亲水性分配作用，还涉及表面吸附、电荷相互作用等多种机制。其中，表面吸附在某些情况下可能对保留行为产生显著影响。例如，某些极性化合物可能在固定相表面直接吸附，而另一些则可能通过吸附水层间接地与固定相发生作用。此外，电荷相互作用在离子化分析物的保留过程中也起到了关键作用。研究表明，通过调节流动相中的盐浓度，可以改变电荷与固定相之间的相互作用强度，从而优化分离效果。因此，HILIC的保留机制是多种因素共同作用的结果，包括固定相的性质、流动相的组成、温度以及分析物的化学特性。

HILIC的传质行为同样受到广泛关注。早期的研究已经揭示了HILIC与反相色谱在传质性能上的差异，特别是在传质系数（B和C项）方面。HILIC的传质过程主要涉及粒子内部的扩散，这在过去十年中成为研究的重点。研究表明，HILIC的传质效率可能受到固定相结构的影响，例如颗粒的大小、形状以及表面特性。此外，流动相的组成也会影响传质行为，例如乙腈含量和盐浓度的变化可能改变吸附水层的结构，从而影响传质过程。因此，研究HILIC的传质行为不仅有助于优化分离效率，还能为理解其整体色谱性能提供理论支持。

在HILIC的热力学研究方面，近年来的关注度有所提升。热力学分析对于理解分析物在色谱柱中的保留行为具有重要意义，尤其是在温度变化对保留的影响方面。例如，保留因子（k）与柱温（T）之间的关系通常通过van’t Hoff方程进行描述。然而，van’t Hoff方程的使用需要假设相比（φ）与温度无关，因此在实际应用中，科学家们需要考虑相比的变化对保留行为的影响。此外，HILIC的热力学行为还可能受到其他因素的影响，例如流动相的组成和固定相的性质。因此，深入研究HILIC的热力学特性，对于优化分离条件和提高分离效率具有重要意义。

HILIC的研究进展不仅体现在理论和实验方法的改进上，还体现在其在实际应用中的广泛使用。随着HILIC技术的不断成熟，其在生物分析领域的应用范围不断扩大，包括对蛋白质、寡核苷酸和肽类物质的分离。这些应用不仅推动了HILIC的发展，也为其在实际样品分析中的可靠性提供了保障。然而，HILIC的研究仍然面临一些挑战，例如如何更精确地预测保留时间、如何优化选择性测试以及如何深入理解吸附水层的形成和变化机制。因此，未来的研究需要在这些方面进行更深入的探索，以进一步推动HILIC在生物分析领域的应用和发展。

总之，HILIC作为一种重要的色谱技术，其研究进展反映了科学界对极性化合物分离机制的深入理解。随着研究的不断深入，我们不仅能够更全面地掌握HILIC的保留、选择性、传质和热力学特性，还能够为其在实际应用中的优化提供理论支持。HILIC的未来发展方向将依赖于对这些基本原理的进一步研究，特别是在吸附水层的结构和形成、保留机制的多样性以及选择性测试的优化等方面。通过不断探索和创新，HILIC有望在生物分析领域发挥更大的作用，为复杂样品的分离提供更高效、更可靠的方法。