基于反相高效液相色谱（HPLC）的双参数检测方法，用于测定人体尿液中激肽原酶的活性

《Journal of Chromatography B》：A reversed-phase HPLC-based dual-parameter assay for the human urinary kallidinogenase enzyme activity

人尿激酶（KN）的酶活性通过RP-HPLC双参数定量法实现高效测定，该法通过同步检测产物p-硝基苯胺和底物消耗提升准确性，优化色谱条件减少基质干扰，并验证了其在生物样品分析中的可靠性。

　　在当前生物制药领域迅速发展的背景下，酶类药物因其独特的生物活性和治疗效果，正成为治疗多种复杂疾病的重要手段。其中，人类尿液中的激肽原酶（Kallidinogenase, KN）作为一种重要的丝氨酸蛋白酶，因其在改善缺血脑区微循环、促进新生血管形成、调节脑组织代谢等方面的显著作用，逐渐被应用于急性脑梗死的治疗。为了确保KN药物的质量和治疗效果，准确测定其酶活性成为药物研发和质量控制过程中不可或缺的一环。

传统的酶活性测定方法多依赖于紫外-可见分光光度法（UV–Vis），这种方法虽然操作简便，但在实际应用中常常受到溶液中底物或基质的干扰，导致测定结果的不准确性和重复性较差。此外，荧光分光光度法、电化学检测法以及滴定法等常规方法也存在类似的局限性，尤其在复杂基质中容易产生误差。为了解决这些问题，研究人员不断探索新的技术手段，例如基于活性化学探针（Activity-Based Probes, ABPs）的检测方法、基于分子印迹聚合物（MIPs）的选择性捕获技术、以及利用量子点（Quantum Dots, QDs）和碳点（Carbon Dots, CDs）作为荧光传感器的高灵敏度检测方法。然而，这些新兴技术在实际应用中仍面临诸多挑战，如化学稳定性不足、合成过程复杂、环境干扰因素较多等，难以实现对KN活性的精准测定。

鉴于此，高分辨率的液相色谱技术（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）因其卓越的分离选择性和定量准确性，逐渐成为酶活性分析的重要工具。特别是在反相高效液相色谱（Reversed-Phase HPLC, RP-HPLC）领域，该技术凭借其高效的分离能力和广泛的适用性，被广泛应用于环境科学、单细胞研究、生物医学、食品安全以及化学工程等多个领域。近年来，随着样品前处理技术的进步和微型化检测手段的发展，RP-HPLC在痕量检测和高效分析方面的能力得到了进一步提升，使得实际样品的快速和准确分析成为可能。因此，RP-HPLC被认为是一种具有潜力的酶活性测定方法，尤其适用于复杂生物基质中的酶分析。

本研究旨在开发一种基于RP-HPLC的双参数定量策略，以实现对人类尿液激肽原酶（KN）活性的高效、准确和可靠测定。该方法通过同时监测反应产物的生成和底物的消耗，能够更全面地反映KN的酶活性。此外，通过优化色谱条件，有效减少了基质干扰，提高了检测的灵敏度和选择性。实验中采用的底物S-2266（H-D-Val-Leu-Arg-pNA）在KN的作用下会被水解，释放出p-硝基苯胺（pNA）作为产物。反应完成后，溶液中主要包含产物pNA、未反应的底物S-2266以及微量的残留KN酶。通过对这些成分的高效分离和精确定量，本研究建立了一种适用于实际样品的KN活性检测方法。

本研究采用的RP-HPLC方法在实验过程中展现出良好的分离效果和高灵敏度。通过多波长检测技术，不仅提高了对产物和底物的识别能力，还增强了检测的稳定性。同时，实验结果表明，该方法在实际应用中具有较高的绿色度，即对环境的影响较小，符合现代分析化学对可持续发展的要求。这使得RP-HPLC方法在生物制药领域中具有广阔的应用前景，尤其是在复杂生物基质中的酶活性分析方面。

此外，该方法的建立也为未来相关研究提供了有力的技术支持。通过结合先进的色谱技术和多参数检测手段，可以进一步拓展其在生物医学研究中的应用范围。例如，在药物开发过程中，该方法可用于评估KN药物在不同条件下的稳定性与活性，为优化药物配方和提高治疗效果提供数据支持。在临床应用中，该方法可用于监测KN药物在体内的代谢情况，为个性化医疗和精准治疗提供依据。同时，该方法的高灵敏度和准确性也为研究KN在多种疾病中的作用机制提供了新的视角，有助于推动其在更多疾病治疗中的应用。

综上所述，本研究通过开发一种基于RP-HPLC的双参数定量策略，成功实现了对人类尿液激肽原酶活性的高效、准确和可靠测定。该方法不仅克服了传统检测手段在复杂基质中的局限性，还展现了良好的绿色度和应用潜力。随着生物制药技术的不断进步，KN作为一类具有重要治疗价值的酶类药物，其活性的准确测定对于保障药物质量和治疗效果具有重要意义。本研究为相关领域的研究者提供了一种可信赖的分析工具，同时也为未来酶类药物的开发和应用奠定了坚实的基础。