开发并应用双光子荧光探针，用于可视化监测植物中的异戊二烯

《Journal of Hazardous Materials》：Development and application of two-photon fluorescent probe for visual monitoring of isoprene in plants

异戊二烯双光子荧光探针TPCM-π-M的构建及其在植物内源异戊二烯动态监测中的应用。该探针具有0.2 ppm检测限和1-240 ppm线性响应，结合双光子成像技术克服传统单光子成像穿透浅、背景干扰大的缺陷，实现植物深层组织异戊二烯空间分布与胁迫响应动态可视化，揭示异戊二烯代谢调控机制及其与作物抗逆性的关联。

　　在植物生理学与环境科学的交叉领域，挥发性有机化合物（VOCs）扮演着至关重要的角色。其中，异戊二烯（isoprene）作为主要的VOCs之一，占据了全球大气中VOCs总量的70%以上，其在植物生态过程中的作用日益受到关注。异戊二烯不仅在植物生长调控、抗逆性以及种间信息传递中发挥着重要作用，还因其在大气化学反应中的参与而成为环境污染物的重要来源。这种“双重效应”使得异戊二烯的研究具有重要的理论和应用价值。然而，目前对植物体内异戊二烯的时空动态监测仍存在诸多限制，这在一定程度上制约了其在环境风险评估和植物生理机制研究中的应用。

针对这一问题，本研究开发了一种基于香豆素（coumarin）的新型双光子荧光探针TPCM-π-M，用于对植物体内异戊二烯的高灵敏度、高选择性检测。该探针通过引入炔基（alkyne）和马来酰亚胺（maleimide）基团，并结合共轭结构的设计，显著提升了其在双光子激发下的性能。实验结果表明，TPCM-π-M在1–240 ppm的浓度范围内表现出良好的线性响应，其检测限为0.2 ppm，能够实现对植物样本中异戊二烯的精准识别。这一突破性进展不仅为异戊二烯在植物代谢和环境适应中的作用提供了新的研究手段，也为环境监测、植物生理学和生物医学成像等领域带来了重要的技术支持。

传统的异戊二烯检测方法主要包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、质子转移反应质谱（PTR-MS）以及电化学传感器等。尽管这些方法在灵敏度、选择性和检测速度等方面各有优势，但它们在实际应用中也面临一些挑战。例如，GC-MS虽然具有较高的分离能力和检测精度，但其检测过程通常需要复杂的样品预处理步骤，限制了其在原位检测中的适用性。而电化学传感器虽然操作简便，但容易受到其他VOCs的干扰，并且在长期使用过程中稳定性较差。PTR-MS虽然能够实现对植物体内异戊二烯的实时检测，但由于其检测方式主要依赖于气体分析，无法提供植物组织内部异戊二烯的空间分布信息。因此，传统方法在解析植物体内异戊二烯的动态变化和其在细胞或组织层面的空间分布方面存在明显的不足。

为了克服上述限制，研究团队引入了双光子荧光成像技术。该技术基于双光子吸收原理，利用长波长激光（如700–1000 nm）进行激发。相较于传统的单光子成像技术，双光子成像能够有效避免叶绿素自荧光的干扰，从而显著提高信噪比。此外，长波长激光在生物组织中具有较低的散射效应和较高的穿透能力，使得研究人员能够在不破坏植物组织结构的前提下，对深层植物组织中的异戊二烯进行清晰的可视化监测。更重要的是，双光子成像技术能够通过空间聚焦的方式，将激发光限制在特定区域，从而减少光漂白和光损伤，实现对植物体内异戊二烯的长期、非侵入性观察。

在探针设计方面，研究团队以香豆素作为核心结构，通过引入三苯胺（triphenylamine）基团赋予其双光子活性。通过扩大分子骨架的维度并延长π共轭体系的长度，进一步增强了探针的双光子吸收能力。最终构建的D–π–A型香豆素衍生物探针具有显著的推拉电子效应，能够实现对异戊二烯的高效识别。为了验证探针的性能，研究团队设计了多个对照探针（TPCM-M、TPCM-C、TPCM-π-C），并通过一系列光学性质测试和异戊二烯响应实验，筛选出性能最优的TPCM-π-M探针。结果显示，TPCM-π-M在灵敏度、选择性和生物相容性方面均优于其他探针，且在深层植物组织中的穿透能力显著增强，能够有效监测异戊二烯的动态变化。

此外，为了进一步探究异戊二烯在植物体内的代谢机制及其与环境胁迫之间的关系，研究团队还结合了类胡萝卜素/光呼吸抑制模型。通过使用氟唑草酯（norflurazon）和亚硫酸氢钠（NaHSO3）等物质，调控植物内部的环境条件，研究团队成功揭示了异戊二烯合成所需的前体和能量来源。同时，利用玉米幼苗作为研究模型，实验还分析了不同胁迫条件对植物体内异戊二烯含量的影响，并探讨了异戊二烯的产生与植物生理健康之间的关联。这些研究不仅加深了对异戊二烯在植物抗逆性中的作用机制的理解，也为评估植物对环境胁迫的响应能力提供了新的视角。

在实际应用方面，该双光子荧光探针TPCM-π-M具有广阔的前景。它不仅可以用于植物生理学研究，帮助科学家更深入地了解异戊二烯在植物代谢和环境适应中的作用，还可以为环境监测提供技术支持。通过实时追踪植物体内异戊二烯的动态变化，研究人员可以更准确地评估植物对大气污染物的响应能力，从而为筛选低排放作物品种、优化城市绿化策略等提供科学依据。同时，该探针在生物医学成像中的应用也值得关注，其高灵敏度和非侵入性检测特性可能为研究生物体内其他挥发性物质的动态变化提供新的工具。

值得注意的是，本研究不仅在技术层面实现了突破，还通过系统性实验设计，揭示了异戊二烯在植物体内的空间分布模式及其在不同环境条件下的变化规律。这种研究方法为未来开展更复杂、更全面的植物VOCs研究奠定了基础。例如，通过结合多组学技术（如基因组学、蛋白质组学和代谢组学），研究人员可以进一步解析异戊二烯的合成途径及其调控机制，从而为植物抗逆性研究和环境治理提供更深入的理论支持。

在实验方法上，本研究采用了多种先进的技术手段，包括荧光成像、光谱分析和生物化学实验等。这些技术的综合应用不仅提高了实验的准确性和可靠性，也增强了对异戊二烯动态变化的解析能力。例如，通过对比单光子荧光探针和双光子荧光探针在植物组织中的成像效果，研究人员能够更直观地观察到双光子成像技术在穿透深度和背景干扰控制方面的优势。这种比较分析有助于进一步优化探针设计和成像条件，提高检测效率和图像质量。

本研究的成果不仅体现在技术层面的创新，还体现在对植物异戊二烯代谢机制的深入理解。通过揭示异戊二烯在植物体内的动态调节机制，研究人员能够更全面地评估其在植物抗逆性中的作用。例如，在光胁迫、高温、干旱等非生物胁迫条件下，异戊二烯的含量和分布模式会发生显著变化，这些变化可能与植物的抗氧化能力、膜稳定性以及光合作用效率密切相关。通过双光子成像技术，研究人员可以更直观地观察到这些变化，从而为植物抗逆性研究提供新的思路和方法。

从环境角度来看，异戊二烯作为大气中重要的生物源挥发性有机化合物，其排放量对空气质量有着深远的影响。异戊二烯与氮氧化物（NOx）反应，生成臭氧和二次有机气溶胶（SOA），这些污染物不仅加剧了区域性的空气污染，还对全球气候变化产生了重要影响。因此，准确监测植物体内异戊二烯的动态变化，对于评估其在环境中的贡献以及制定相应的治理策略具有重要意义。本研究开发的TPCM-π-M探针，能够实现对植物体内异戊二烯的高灵敏度、高选择性检测，为环境监测提供了新的工具。

此外，本研究还对不同植物花器官中异戊二烯的含量与其抗逆能力之间的关系进行了探讨。实验结果表明，不同花器官中异戊二烯的含量存在显著差异，这种差异可能与植物的生理状态、环境适应能力以及基因表达水平有关。通过进一步研究这些差异，科学家可以更全面地了解异戊二烯在植物不同器官中的功能差异，为植物育种和生态研究提供新的数据支持。

在实际应用中，TPCM-π-M探针的开发为植物生理学、环境科学和生物医学成像等多个领域带来了重要的技术突破。其高灵敏度和非侵入性检测特性，使得研究人员能够在不破坏植物组织的前提下，对异戊二烯的动态变化进行实时监测。这种能力不仅有助于深入研究植物对环境胁迫的响应机制，还为植物代谢调控、环境污染物来源分析以及生物医学成像提供了新的可能性。同时，该探针的应用也拓展了荧光成像技术在复杂生物系统中的研究范围，推动了多学科交叉融合的发展。

综上所述，本研究通过开发一种新型双光子荧光探针TPCM-π-M，成功实现了对植物体内异戊二烯的高灵敏度、高选择性检测，并揭示了其在不同环境条件下的动态变化规律。这一成果不仅为植物生理学和环境科学提供了新的研究工具，也为未来开展更深入的植物代谢研究和环境治理策略制定奠定了坚实的基础。同时，该探针的应用也展示了双光子成像技术在生物医学和生态研究中的巨大潜力，具有重要的理论和实践价值。