结构快照能够捕捉μ-阿片受体处的核苷酸释放过程

《Nature》：Structural snapshots capture nucleotide release at the μ-opioid receptor

阿片受体μ-阿片受体（MOR）激活G蛋白的分子机制研究，结合药理学实验与冷冻电镜、分子动力学模拟，揭示了GDP结合状态与受体构象变化的关系。研究显示，MOR通过8种独特的结构中间态（潜伏、投入、未锁定、准备）调控GDP释放速率，其中拮抗剂纳洛酮稳定潜伏态，降低GDP亲和力；而超激动剂洛哌丁胺促进投入态向准备态转变，加速GDP释放。分子动力学模拟证实，α5螺旋延伸和AHD域构象变化是GDP解离的关键驱动力，为优化阿片类药物安全性提供了结构基础。

　　μ-阿片受体（MOR）作为G蛋白偶联受体（GPCR）超家族中的一员，通过开启Gα α-螺旋结构域（AHD）来促进G蛋白的异三聚体结构中GDP与GTP的交换过程。GDP的释放是该过程中决定性的步骤。通过药理学实验，我们发现激动剂的效力与GDP结合的亲和力下降相关，从而促进GTP交换；而拮抗剂则会增加GDP的亲和力，抑制激活过程。进一步研究这一现象，我们提供了8种独特的结构模型和16个低温电子显微镜（cryoEM）图谱，捕捉了MOR在与纳洛酮或洛哌丁胺结合时的多个中间构象，这些构象沿着激活路径演变。其中包括四种此前未被描述的受体-G蛋白界面、AHD的排列方式以及在GTP结合位点中需要GDP释放的结构变化。纳洛酮将MOR稳定在一种“潜伏”状态，而洛哌丁胺则促使MOR进入一种“激活”状态，该状态结构上为AHD结构域的开启和随后的GDP释放做好了准备。这些发现得到了分子动力学（MD）模拟的支持，揭示了GDP结合的中间态和AHD的构象在G蛋白激活和配体效力中的关键作用，为G蛋白偶联受体的药理学提供了结构和机制上的新见解。

MOR在临床中具有重要的应用价值，广泛用于疼痛管理。然而，针对MOR的激动剂存在高度的滥用风险，并且与严重副作用相关，这使得解决这些关注点成为当前药物开发的优先事项。现有的多种调节剂可用于治疗阿片类药物过量，其中纳洛酮是最广泛应用的实例。通常认为纳洛酮是一种拮抗剂，但一些早期研究已经表明它具有低效力的部分激动剂活性。部分激动剂被认为比传统使用的MOR激动剂更具安全性和更好的治疗特性，但设计具有定制效力的配体的能力受到对不同水平激动作用如何在细胞内传递的机制理解的限制。

在G蛋白偶联受体药理学中，配体被分类为根据其对下游信号传导的调节方式和程度，即效力，来影响信号传导。拮抗剂会阻止激活，完全激动剂会产生最大激活，部分激动剂则产生次优响应，而超激动剂则会产生超优响应，相对于参考激动剂。GDP结合状态在G蛋白激活中扮演着关键角色，但目前缺乏高分辨率的这些中间状态的结构快照，这限制了我们对GPCR信号传导机制的了解。本研究通过药理学实验、单颗粒低温电子显微镜（cryoEM）实验和分子动力学（MD）模拟，确认了效力确实与GDP释放速率相关，而这些速率被特定的构象状态所调节。

我们观察到，当MOR处于不同的GDP结合状态下时，其配体效力表现出明显的差异。纳洛酮在所有实验系统中表现出部分激动剂活性，其效力范围在10%到30%之间。通过实验，我们确认了纳洛酮的部分激动剂活性，其中使用[3H]纳曲酮进行的放射配体结合实验显示，随着GDPβS浓度的增加，其结合亲和力下降。这一结果与早期研究一致，表明阿片类激动剂的结合受到核苷酸的影响，而纳洛酮的结合则不受影响。

为了验证配体效力与核苷酸结合亲和力之间的联系，我们采用了RG-BRET实验。在这一实验中，我们检测了核苷酸浓度依赖的BRET信号，作为核苷酸亲和力的代理。通过使用digitonin使细胞膜通透化，并利用apyrase水解核苷酸，我们进行了核苷酸剂量反应实验，使用非水解的核苷酸衍生物（如GDPβS和GTPγS）。在这些实验中，我们观察到MOR在无核苷酸状态下具有较高的GDPβS半数有效浓度（EC50）为57 ± 14 nM，而GTPγS的EC50为3.8 ± 0.18 nM。使用洛哌丁胺进行实验时，GDPβS的EC50显著增加至1.7 ± 0.7 μM，GTPγS的EC50则为25 ± 4.4 nM。这些数据表明，激动剂确实会降低GDP的亲和力，而拮抗剂则可能增加GDP的亲和力。在细胞内，我们还观察到类似的趋势，但信号变化在某些情况下太小，难以解释，这可能与内源性核苷酸的竞争有关。

进一步的实验表明，细胞内的GDP和GTP浓度估计分别为50 μM和500 μM，这意味着两者之间存在持续的竞争压力。我们还采用了我们的nuc-BRET实验来模拟这种竞争，通过逐步增加GDPβS的浓度，同时测定GTPγS的EC50值。在无配体的情况下，GTP的EC50范围从2.9 ± 0.68 nM到13 ± 2.0 nM，而纳洛酮的EC50则从4.5 ± 0.58 nM增加到39 ± 5.3 nM。这些结果进一步支持了配体效力与GDP亲和力之间的直接联系。我们还通过实验观察到，GTP结合在激动剂结合状态下仅受到轻微影响，而在反向激动剂结合状态下则更为显著。

通过单颗粒cryoEM实验，我们获得了MOR激活路径的六个构象状态，其中观察到了四种不同的GDPβS结合状态。这些状态提供了G蛋白与受体相互作用和激活过程的结构快照。我们命名了这些状态为“潜伏”、“激活”、“未解锁”和“预激活”，在这些状态之间观察到一系列的构象变化，显示出GDP亲和力的逐步下降。此外，我们还确定了MOR的无核苷酸状态（3.4 ?）和核苷酸自由状态下的MOR-G蛋白结构（3.0 ?）。在文章中，我们详细比较了纳洛酮的“潜伏”状态和洛哌丁胺的“激活”状态，以探讨它们在G蛋白激活中的作用。

纳洛酮的“潜伏”状态显示，G蛋白与受体之间的相互作用是通过所有三个胞内环（ICLs）进行的。而洛哌丁胺的“激活”状态则显示出G蛋白的α5螺旋向受体核心延伸了14 ?，旋转了60°，并朝向MOR移动了6 ?，同时下沉至RHD（Ras-homology domain）约3 ?。这些变化导致了与无核苷酸状态相似的界面，但同时也显示出一些关键的G蛋白-核苷酸相互作用的破坏，以及保守的F336从其由β2、β3和α1形成的疏水口袋中移出，改变了稳定GDP结合的网络。此外，激活状态的AHD保持闭合，但相对于RHD旋转了13°，并且αA螺旋变得笔直。在核苷酸结合位点，这一状态显示出TCAT环的部分回缩，而C325与GDP的氢键保持不变。α5上的F334指向TCAT环，而β6上的H322则指向Gα的C端。α1/P环向TCAT移动了1.2 ?，并在后续的构象状态中继续这一轨迹。随着AHD的旋转，我们观察到R176的构象改变，其旋转体向TCAT倾斜了20°，同时D150失去了与GDP的大部分疏水相互作用，而AHD中仅剩的与GDP相互作用的残基是S151。这一变化导致了SwI的重新配置，SwI部分打开并指向α1，使得R178旋转了近90°。R178的胍基占据了形成Mg2?口袋的空腔，与β3上的D200和β磷酸基团形成离子相互作用。这一R178构象在所有五条MD轨迹中保持稳定，表明这一构象对于GDP释放至关重要。

我们还观察到了未解锁状态的动态AHD，这可能表明在某些情况下，随机碰撞可能会阻止GDP释放。最后，预激活状态显示出“门控”机制，其中AHD的回缩导致αF螺旋的回缩，从而显示出所有状态中最为动态的GDP协调。在某些MD轨迹中，这一状态最终导致了GDP的释放。此外，一些未解锁状态的MD轨迹逐渐转化为预激活状态，同样导致了GDP的释放。这表明，尽管我们采用了“重新结合GDP”的方法，这些状态仍然能够重新结合GDP，并且在实验条件下保持稳定。

通过这些实验，我们揭示了MOR配体效力与GDP释放速率之间的关系，即效力通过改变受体构象的平衡来克服G蛋白激活过程中的速率限制步骤。拮抗剂和部分激动剂会将MOR-G蛋白复合物稳定在潜伏状态，这可能意味着GDP释放速率较低，而激动剂如洛哌丁胺则会促使MOR进入激活状态，该状态结构上为AHD的开启和GDP释放做好了准备。这些发现不仅深化了我们对G蛋白激活和配体效力的机制理解，还为G蛋白偶联受体的药理学研究提供了新的视角。此外，我们的研究还表明，逆向激动剂通过主要稳定潜伏状态来发挥作用，这可能解释了为什么在某些情况下，MOR拮抗剂的结合不受核苷酸存在的影响。

总体而言，这些发现为理解MOR配体效力与G蛋白激活之间的关系提供了重要的结构和机制见解。通过揭示配体如何稳定不同的构象状态，进而影响GDP释放速率，我们为设计具有定制效力的配体提供了理论基础。这不仅有助于开发更安全的治疗方案，还可能为其他GPCR的药理学研究提供借鉴。