利用基于四面体DNA纳米结构的hESC平台，对心脏肥大中的EGFR/Ca2+信号调节剂进行高通量筛选

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：High-Throughput Screening of EGFR/Ca2+ Signaling Modulators in Cardiac Hypertrophy Using a Tetrahedral DNA Nanostructure-Based hESC Platform

心脏肥厚是一种由EGFR激活和钙稳态失调引发的心脏疾病，传统治疗手段效果有限。本研究创新性地开发了一种四聚体DNA纳米结构探针（TDN-EA），通过荧光共振能量转移（FRET）机制实现EGFR与Ca2+信号的实时同步监测。利用该探针构建的高通量筛选平台，从420种天然化合物中鉴定出新型抗心脏肥厚候选药物PM（帕拉莫霉素）。PM通过直接结合EGFR抑制其下游信号通路，减少磷酸化PLB和cTnI水平，从而调控钙离子摄取和心肌收缩功能。体内实验证实PM能显著缓解压力负荷诱导的心脏肥厚和转基因小鼠模型中的心肌重构，且具有良好安全性。该研究为靶向EGFR/Ca2+双通路的心脏疾病治疗提供了新策略和工具。

　　心脏肥大是一种心脏功能障碍的前兆，其背后涉及复杂的信号传导网络，包括表皮生长因子受体（EGFR）的激活和钙离子（Ca2?）的调控异常。当前，针对EGFR信号通路的抑制被视为一种有前景的治疗策略，因为它能够有效减少不适应性肥厚重塑，并在一定程度上恢复心脏的钙离子稳态。然而，传统的药物筛选方法在这一领域存在一定的局限性，主要体现在人类心肌细胞增殖能力有限以及缺乏能够同时监测EGFR和Ca2?信号的实时探针。为了解决这些问题，研究团队开发了一种基于四面体DNA纳米结构的探针（TDN-EA），结合了由人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞（hESC-CMs），用于在活细胞中对EGFR和Ca2?信号进行实时、同步检测。这一探针在hESC-CMs中展现了高度的特异性、稳定性和生物相容性。

研究还建立了一个高通量筛选平台，通过从420种天然化合物中筛选，最终识别出一种名为帕罗霉素（Paromomycin，简称PM）的新型治疗候选药物。PM在体外和体内实验中均显示出对心脏肥大的显著抑制效果，其作用机制涉及对EGFR/Ca2?信号通路的抑制。这种药物不仅能够减少EGFR的活性，还能通过调节钙离子的再摄取过程，改善心脏功能。研究结果表明，TDN-EA作为工具，不仅在药物筛选中表现出色，而且为发现针对心脏肥大的靶向治疗药物提供了新的可能。

心脏肥大的研究对于开发新的治疗策略至关重要，因为它不仅与心力衰竭密切相关，还与其他心血管疾病如高血压和心肌重构有关。现有的治疗方案主要依赖于β受体阻断剂、钙通道阻断剂和血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂，这些药物旨在通过调节血流动力学参数、减轻心脏负担以及抑制不适应性神经激素激活来改善心脏功能。然而，目前尚缺乏专门针对心肌细胞并直接缓解心脏肥大的药物。因此，寻找能够同时调控EGFR和Ca2?信号的药物成为研究的重点。

近年来，通过人类诱导多能干细胞（hiPSC）和人类胚胎干细胞（hESC）生成心肌细胞的技术取得了显著进展，为心脏肥大相关药物的开发提供了新的途径。EGFR作为erbB家族中的受体酪氨酸激酶，在调控细胞生长和存活方面发挥着关键作用，近年来也被认为是心脏肥大的潜在诱因之一。EGFR的抑制不仅可以减少其不适应性信号传导，还可以通过调节蛋白磷酸酶2A（PP2A）来影响钙离子稳态。钙离子稳态的破坏是心脏肥大的显著特征之一，导致心肌收缩功能的改变和病理重塑的加剧。因此，开发能够针对EGFR/Ca2?信号通路的心肌细胞抑制剂，对于治疗心脏肥大具有重要意义。

TDN-EA探针的设计和应用是本研究的核心。该探针基于四面体DNA纳米结构，利用荧光共振能量转移（FRET）机制，通过靶标结合触发结构变化，从而实现对EGFR和Ca2?的同步检测。在体外实验中，TDN-EA能够有效检测EGFR和Ca2?的变化，并且表现出良好的稳定性，即使在含有10%胎牛血清（FBS）的生理条件下也能维持其结构完整性。通过原子力显微镜（AFM）和透射电镜（TEM）的分析，研究团队确认了TDN-EA的形态特征，包括其均匀的大小和分布。这些结果为探针的生物相容性和功能性提供了坚实的基础。

为了验证TDN-EA的生物相容性和检测能力，研究团队进行了多种实验。例如，通过细胞毒性评估发现TDN-EA在低浓度下（0–200 nM）对细胞无明显毒性，且在10分钟内即可被心肌细胞高效摄取。这些特性使得TDN-EA成为一种理想的工具，用于高通量药物筛选。在使用TDN-EA的筛选平台中，研究团队对420种天然化合物进行了测试，发现其中八种化合物对EGFR/Ca2?信号通路具有显著的抑制作用，包括已知的EGFR抑制剂如阿法替尼（Afatinib）、厄洛替尼（Erlotinib）等。然而，帕罗霉素（PM）作为一种FDA批准的抗生素，其在心脏肥大治疗中的作用尚未被广泛研究。通过进一步的实验，研究团队发现PM能够有效抑制EGFR活性，并通过调节钙离子的再摄取机制，改善心脏功能。这些发现不仅证明了PM在心脏肥大治疗中的潜力，也凸显了TDN-EA在药物筛选中的重要价值。

在细胞层面，研究团队使用TDN-EA对EGFR和Ca2?信号的变化进行了详细分析。实验结果显示，TDN-EA在检测EGFR和Ca2?时表现出高度的特异性，即使在存在多种干扰物质的情况下，也能准确区分靶标信号。此外，TDN-EA在细胞内的分布和信号传导过程得到了验证，其能够有效地监测EGFR的动态变化。通过RNA测序和通路富集分析，研究团队进一步揭示了PM对EGFR信号通路的影响，发现其能够显著降低关键下游效应分子如磷酸化ERK1/2、磷酸化MEK1/2和磷酸化AKT的表达水平，同时不影响这些蛋白的总表达水平。这些结果表明，PM能够直接抑制EGFR活性，从而减少其介导的不适应性信号传导，减轻心脏肥大。

为了进一步验证PM的治疗效果，研究团队在小鼠模型中进行了体内实验。通过使用横纹主动脉缩窄（TAC）模型，研究团队观察到PM能够显著减少心脏肥大，改善心脏功能。具体表现为心脏大小的减少、心肌细胞组织结构的恢复以及纤维化程度的降低。此外，PM在TAC模型中未表现出明显的全身毒性，且其在血液中的浓度维持时间较长，说明其具有良好的生物利用度和体内稳定性。这些结果不仅支持了PM在心脏肥大治疗中的应用前景，也为TDN-EA在药物筛选中的实际应用提供了有力的证据。

在临床相关的模型中，研究团队还使用了携带Tnnt2 R109Q突变的敲入（KI）小鼠模型，该模型能够模拟心脏肥大的病理特征。实验结果显示，PM能够显著减轻该突变导致的心肌肥大，并且在不引起明显副作用的情况下，恢复心脏功能。这表明PM不仅在体外具有良好的治疗效果，而且在体内也展现出较高的安全性和有效性。这些发现为未来的心脏肥大治疗提供了新的药物选择，并且展示了TDN-EA在药物筛选中的强大能力。

本研究通过TDN-EA探针的开发和应用，为心脏肥大的治疗提供了新的思路。TDN-EA不仅能够实现对EGFR和Ca2?信号的实时监测，还能够作为高通量筛选平台，帮助识别具有治疗潜力的化合物。帕罗霉素（PM）的发现表明，即使是已经被批准用于其他疾病的药物，也可能在心脏肥大治疗中发挥重要作用。这一研究结果强调了利用新型检测技术进行药物筛选的重要性，并为未来的心脏疾病治疗研究提供了重要的参考。

综上所述，EGFR/Ca2?信号通路在心脏肥大的发生和发展中起着关键作用。通过开发TDN-EA探针，研究团队不仅解决了传统药物筛选方法在这一领域的局限性，还为寻找新的治疗策略提供了工具。帕罗霉素的发现进一步表明，这种药物可能成为一种具有潜力的治疗候选，其作用机制涉及对EGFR和钙离子信号的双重调节。研究结果不仅为心脏肥大的治疗提供了新的方向，也为DNA纳米技术在生物医学领域的应用拓展了可能性。未来，随着相关技术的不断进步，类似的研究有望在更多心血管疾病治疗中发挥重要作用。