一种新型、快速、灵敏且高通量的UPLC-MS/MS方法的开发、验证及四年临床应用：该方法用于同时测定50 μL血清中的维生素A和维生素E

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Development, Validation, and Four-Year Clinical Application of a Novel, Rapid, Sensitive, and High-Throughput UPLC MS/MS Method for the Simultaneous Determination of Vitamins A and E in 50 μL of Serum

本研究开发了一种高效液相色谱-串联质谱法，可从50μL血清中精准测定维生素A和E，解决了小样本检测难题。经验证，该方法线性范围宽（VA：0.01-2.0μg/mL；VE：0.1-20.0μg/mL），准确度误差<10%，精密度RSD<10%。分析2173名<1岁健康婴儿数据，建立本地参考值（VA中位数0.3μg/mL，95%CI 0.17-0.47；VE中位数10.8mg/L，95%CI 5.60-18.5），并发现发热咳嗽组VE水平显著降低（p<0.05），睡眠障碍和湿疹组VA无显著差异。

　　维生素A和维生素E是人体必需的脂溶性维生素，它们在维持正常生理功能方面发挥着关键作用。尤其是在婴儿和幼儿阶段，维生素A和E的摄入对于视觉发育、免疫系统功能、细胞生长和神经系统的健康至关重要。然而，传统的检测方法往往需要较大的血样量，这在婴儿群体中带来了采集困难和家长抵触的问题。为此，本研究开发了一种新的、高灵敏度、高准确度且高通量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，能够在仅需50微升血清样本的情况下完成维生素A和E的定量分析，从而有效克服了样本量不足带来的检测挑战。

本研究采用的方法首先通过乙腈蛋白沉淀和96孔固相萃取技术进行样品预处理，确保了检测过程中对干扰物质的有效去除。随后，使用BEH苯基柱（2.1×100毫米，1.7微米）进行色谱分离，流动相由0.1%甲酸水溶液和甲醇组成，以提高分离效率和检测准确性。通过使用同位素标记的内标物（IS）进行校准，该方法在检测性能方面表现出色。具体而言，内标归一化后的基质效应平均值在87.99%至107.22%之间，相对标准偏差（RSD）小于10%；回收率在96.06%至102.93%之间，RSD小于15%；准确度偏差小于10%，精密度RSD也小于10%。这些结果表明，该方法在检测维生素A和E方面具有良好的稳定性和可靠性。

在临床应用方面，本研究对2137名健康婴儿（年龄小于1岁）进行了血清维生素A和E水平的检测，结果表明超过97.9%的婴儿维生素A和E水平均在Mayo Clinic参考范围内。进一步分析发现，维生素A的中位数为0.3微克/毫升（95%置信区间：0.17–0.47），维生素E的中位数为10.8毫克/升（95%置信区间：5.60–18.5）。这些数据为建立本地参考值提供了重要依据，有助于临床医生在实际诊疗中更准确地评估婴儿的维生素营养状况。

此外，研究还对234名患有临床疾病诊断的婴儿进行了分析，包括睡眠障碍（n=85）、发热咳嗽（n=62）和湿疹（n=87）。结果显示，维生素A水平在睡眠障碍组和发热咳嗽组中显著低于健康体检组（p < 0.001），而在湿疹组中则未发现显著差异（p > 0.05）。同样，维生素E水平在发热咳嗽组中也显著低于健康体检组（p < 0.05），而在睡眠障碍组和湿疹组中则未发现显著差异（p > 0.05）。这些结果提示维生素A和E水平可能与某些疾病状态存在一定的关联，为临床营养干预提供了新的思路。

在婴儿群体中，维生素A和E的来源主要包括母乳、婴儿乳粉以及辅助食品。由于个体间维生素代谢效率的差异，可能影响补充效果，因此对婴儿血清中维生素A和E水平的监测显得尤为重要。然而，传统的检测方法往往需要较大的血样量，这在婴儿群体中带来了采集难度和家长接受度的问题。此外，这些方法通常需要较长的样品前处理时间，使用较高毒性的有机溶剂，或者分析时间较长（超过10分钟），导致其在高通量临床样本分析中的应用受限。因此，开发一种能够快速、准确、高通量检测维生素A和E的方法具有重要的临床意义。

本研究开发的UPLC-MS/MS方法仅需约150微升指尖血即可准确测定血清中的维生素A和E水平，这一方法已在医院的临床儿科部门实施了四年，显示出良好的操作可行性和家长接受度。通过这种方法，不仅能够有效解决样本量不足的问题，还能提高检测效率，满足临床对大批量样本快速分析的需求。同时，该方法在检测过程中表现出良好的选择性，空白血清中未检测到分析物和内标物，而在质量控制样品和临床样品中均能正常检测，且在保留时间范围内未出现共流出峰，进一步保证了检测结果的准确性。

在方法验证方面，该方法的线性范围在维生素A为1.0×10?2至2.0微克/毫升，维生素E为0.1至20.0微克/毫升。通过使用1/x2加权的二次多项式回归分析，校准曲线表现出良好的相关系数（r > 0.99），并具有较小的误差范围。这些结果表明，该方法在宽泛的浓度范围内均能提供可靠的定量数据，适用于不同临床需求的样本分析。

综上所述，本研究开发的UPLC-MS/MS方法不仅在技术上具有创新性，还在实际应用中表现出良好的可行性和适应性。该方法能够有效解决传统检测方法在样本量、操作时间和毒性方面的局限，为婴儿维生素A和E水平的检测提供了新的解决方案。同时，该方法在临床应用中表现出良好的稳定性和准确性，有助于建立本地参考值，提高对婴儿维生素营养状况的评估水平，从而为临床医生提供更科学的诊断依据。此外，该方法的推广和应用有望改善婴儿群体的营养监测现状，为婴幼儿健康管理和疾病预防提供支持。