基于三苯胺的荧光探针用于脂滴检测和非酒精性脂肪肝病的识别

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Triphenylamine-based fluorescent probes for lipid droplet detection and non-alcoholic fatty liver disease identification

本研究设计并合成三种基于三苯基胺的荧光探针DM-1至DM-3，发现DM-1具有高灵敏度（R2=0.9888）、低细胞毒性及近红外发射特性，成功实现NAFLD小鼠模型肝脂滴的活体成像，为早期诊断提供新工具。

　　在当今生命科学研究中，脂质滴（Lipid Droplets, LDs）作为重要的细胞结构，其动态变化与多种代谢性疾病密切相关，尤其是非酒精性脂肪肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）。NAFLD已成为全球范围内威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率持续上升，给公共卫生体系带来了巨大挑战。由于LDs在细胞内的积累与NAFLD的发生发展直接相关，因此对LDs的精准检测与实时监测成为早期诊断和干预治疗的关键。本研究聚焦于开发一种新型的荧光探针，旨在提升对LDs的识别能力，同时满足高灵敏度、高选择性以及良好的生物相容性等要求。

传统方法在检测LDs方面存在诸多局限性。例如，常用的油红O染色和苏木精-伊红（H&E）染色虽然能够直观地显示LDs的分布，但其操作繁琐、检测周期长，且分辨率较低，难以满足动态监测的需求。电子显微镜虽然能够提供高分辨率的细胞结构图像，但其操作复杂、设备昂贵，且无法用于活体检测。拉曼成像、光学衍射层析和高效液相色谱等技术虽然在某些情况下表现良好，但同样存在设备成本高、技术门槛高以及现场应用受限等问题。因此，开发一种更高效、更便捷的检测手段显得尤为迫切。

相比之下，荧光成像技术因其快速、非侵入性、操作简便以及低背景干扰等优势，成为LDs检测的优选方案。然而，现有的商用荧光探针如BODIPY 493/503和尼罗红（Nile Red）虽然在一定程度上满足了研究需求，但它们在实际应用中仍存在诸多不足。例如，这些探针对环境的抗干扰能力较弱，导致在复杂生物体系中出现假阳性或假阴性结果；其荧光寿命较短，难以实现长时间的活体追踪；此外，其价格昂贵，限制了其在临床诊断中的广泛应用。因此，研究者们不断探索新的荧光探针设计策略，以期在保持高灵敏度和特异性的同时，提高其抗干扰能力、延长荧光寿命，并降低成本。

本研究基于三苯胺（triphenylamine）作为核心荧光基团，设计并合成了三种新型荧光探针——DM-1、DM-2和DM-3。三苯胺作为一种具有独特光学性质的分子，其结构中含有多个共轭π键和氮原子，这使得它在荧光成像领域具有良好的应用前景。通过引入硫杂环戊烯（thiophene）环，研究人员进一步优化了探针的共轭结构，从而增强了其荧光性能。此外，通过调整不同的取代基，研究人员构建了经典的供体-π-受体（D-π-A）结构，这种结构能够有效调节探针的电子供体能力，从而提升其对极性环境的响应能力。

在实验过程中，研究人员首先对三种探针的光物理性质进行了系统研究。通过在不同溶剂中测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，发现DM-1在PBS/Diox（80–96%）溶液中表现出良好的线性响应，其荧光强度在576 nm波长处与极性环境之间存在显著的相关性（R2 = 0.9888）。这一特性表明DM-1能够准确地反映LDs的极性变化，为后续的生物成像研究提供了坚实的理论基础。此外，DM-1的发射波长位于近红外区域（>650 nm），这使其在生物组织中的穿透能力更强，减少了组织对荧光信号的干扰，提高了成像的清晰度和准确性。

为了验证探针在生物系统中的实际应用效果，研究人员进一步开展了细胞实验。他们选择HepG2细胞作为模型系统，以评估DM-1、DM-2和DM-3对LDs的靶向识别能力。实验结果表明，DM-1在细胞内能够高效地富集于LDs区域，显示出明显的荧光信号，且其细胞毒性极低，细胞存活率在不同浓度下均保持在98%以上。这说明DM-1不仅具有良好的生物相容性，还能够在活细胞中实现对LDs的精准检测，为后续的体内成像研究奠定了基础。

在体内实验中，研究人员利用DM-1对NAFLD小鼠模型进行了成像研究。结果显示，DM-1能够有效识别不同阶段的NAFLD肝脏中LDs的分布情况，为疾病的发展过程提供了直观的可视化证据。这一成果不仅验证了DM-1在活体环境中的适用性，还展示了其在疾病早期诊断和动态监测方面的潜力。通过结合荧光成像与体内实验，研究人员进一步确认了DM-1在实际应用中的可靠性，为未来的临床转化提供了重要支持。

在探针的合成过程中，研究人员采用了一种高效的化学方法，通过将化合物L-2与柠檬酸（levulinic acid）在二氯甲烷中进行反应，成功合成了DM-1、DM-2和DM-3。该反应体系包含DMAP（4-二甲氨基吡啶）和EDCI（N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺）作为催化剂，确保了反应的高效进行。反应完成后，通过薄层色谱（TLC）确认了反应的完成情况，并利用二氯甲烷作为溶剂进行提取和浓缩。最终，通过硅胶柱色谱法对产物进行了纯化，得到了结构清晰、光学性能优良的探针。

探针的光物理性质不仅决定了其在溶液中的表现，也直接影响了其在生物系统中的应用效果。研究人员通过系统研究发现，DM-1、DM-2和DM-3均对小极性环境具有良好的响应能力。其中，DM-1表现出最优异的性能，包括高灵敏度、高选择性、较大的斯托克斯位移（Stokes shift）以及较高的荧光量子产率。这些特性使得DM-1能够在复杂的生物环境中准确识别LDs，而不会受到其他成分的干扰。此外，DM-1在宽pH范围内（2–8）均能保持稳定的荧光性能，进一步拓宽了其应用范围。

除了光物理性质，探针的靶向识别能力也是其在生物成像中发挥关键作用的重要因素。研究人员通过荧光显微镜观察发现，DM-1能够特异性地结合到LDs表面，并在细胞内显示出清晰的荧光信号。这种靶向能力不仅来源于探针的脂溶性特性，还与其分子结构中的极性敏感基团密切相关。通过调节供体和受体之间的电子转移效率，研究人员实现了探针对LDs极性环境的精准响应。这种响应机制使得DM-1能够在不同生理状态下准确反映LDs的代谢状态，从而为疾病诊断提供重要的依据。

在实际应用中，DM-1的优异性能使其成为一种理想的荧光探针。其近红外发射特性使其在生物组织中的成像效果更加突出，减少了组织对荧光信号的吸收和散射，提高了成像的穿透深度和清晰度。同时，DM-1的高斯稳定性（photostability）使其能够在长时间的活体成像过程中保持稳定的荧光信号，避免了因光漂白而导致的信号衰减问题。这些特性不仅提升了DM-1的检测能力，也增强了其在临床应用中的可行性。

为了进一步验证DM-1在体内成像中的应用效果，研究人员在NAFLD小鼠模型中进行了实验。实验结果显示，DM-1能够有效识别不同阶段的NAFLD肝脏中的LDs分布情况，并呈现出清晰的荧光图像。这种成像能力不仅为NAFLD的早期诊断提供了新的工具，也为疾病的发展过程提供了直观的观察窗口。通过结合荧光成像技术与体内实验，研究人员能够实时监测LDs的动态变化，从而更深入地理解NAFLD的病理机制。

本研究的成果表明，DM-1作为一种新型的极性敏感荧光探针，在LDs的检测和NAFLD的诊断中具有重要的应用价值。其高灵敏度、高选择性以及良好的生物相容性，使其成为一种理想的生物成像工具。此外，DM-1的近红外发射特性也为其在临床诊断中的应用提供了广阔的空间。未来，研究人员可以进一步优化DM-1的性能，探索其在其他代谢性疾病中的应用潜力，为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的思路和方法。

在探针的设计和合成过程中，研究人员还注重了其在实际应用中的可操作性和经济性。通过合理选择合成原料和优化反应条件，他们成功地降低了探针的生产成本，使其在实际应用中更具可行性。同时，DM-1的合成过程相对简单，能够实现大规模生产，为后续的临床转化和广泛应用提供了保障。这种低成本、高效率的合成策略，不仅有助于探针的推广使用，也为其他类似探针的开发提供了参考。

此外，DM-1的抗干扰能力也是其在生物成像中的一大优势。在复杂的生物体系中，许多其他分子可能对荧光信号产生干扰，影响检测的准确性。然而，DM-1的分子结构设计使其能够有效避免这种干扰，确保在多种环境条件下均能保持稳定的荧光性能。这一特性使得DM-1不仅适用于实验室研究，也能够在临床环境中发挥重要作用，为疾病的诊断和监测提供可靠的数据支持。

在细胞实验中，研究人员还通过共定位实验验证了DM-1对LDs的识别能力。他们将DM-1与传统的脂质染色剂（如油红O）进行共定位分析，发现DM-1能够准确地识别LDs的分布位置，且与油红O的荧光信号具有良好的一致性。这一结果不仅证明了DM-1在细胞内的靶向识别能力，还表明其在生物成像中的可靠性。通过进一步优化探针的分子结构，研究人员可以提升其在不同细胞类型中的适用性，拓展其在多种疾病模型中的应用范围。

综上所述，本研究成功开发了一种新型的极性敏感荧光探针DM-1，并验证了其在LDs检测和NAFLD诊断中的应用潜力。DM-1不仅具有优异的光学性能，还表现出良好的生物相容性和抗干扰能力，使其成为一种理想的生物成像工具。未来，研究人员可以进一步探索DM-1在其他代谢性疾病中的应用，同时优化其性能，以期实现更广泛的应用。这一研究成果为NAFLD的早期诊断和动态监测提供了新的技术手段，也为相关疾病的防治策略提供了重要的理论依据。