负载肉桂醛的壳聚糖纳米颗粒经DNase-I修饰后对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗菌膜形成活性

《LWT》：Antibiofilm activity of cinnamaldehyde-loaded chitosan nanoparticles functionalized with DNase-I against Listeria monocytogenes

DNase-I功能化壳聚糖纳米颗粒（DNase-CS-CIN）通过破坏生物膜结构、降解外源DNA和调控基因表达，有效抑制单菌（李斯特菌）和混合菌（李斯特菌与荧光假单胞菌）生物膜形成与清除，并在模拟食品加工环境中展现温度依赖性活性，为食品接触表面生物膜防控提供新策略。

　　本研究探讨了一种新型的抗生物膜剂——DNase-I功能化的壳聚糖纳米颗粒负载肉桂醛（DNase-CS-CIN）在食品加工环境中对抗李斯特氏菌（*L. monocytogenes*）生物膜的潜力。由于生物膜的形成使得李斯特氏菌在食品接触表面如不锈钢和聚氨酯表面具有较强的耐受性，传统化学消毒剂在消除生物膜方面效果有限。因此，寻找一种既能有效清除生物膜，又具有环境友好性和生物安全性的方式成为当前研究的重点。研究结果表明，DNase-CS-CIN在形态、尺寸和功能化程度方面表现出显著优势，能够有效抑制和消除李斯特氏菌的生物膜形成，并在模拟食品加工环境中展现出良好的抗生物膜性能。

### 生物膜的挑战与抗生物膜研究的重要性

生物膜是一种由细菌分泌的生物聚合物组成的结构，能够显著增强其对环境胁迫的耐受能力，如高温、抗生素和消毒剂。李斯特氏菌作为引起致命性食物中毒的主要病原体之一，其在食品加工设备上的附着和生物膜形成，是食品行业面临的重要食品安全问题。李斯特氏菌在生物膜状态下，不仅难以通过常规清洗方法去除，还可能成为交叉污染的源头，给食品生产带来巨大的经济损失。因此，研究有效的抗生物膜策略具有重要的现实意义。目前，许多研究集中在开发具有抗菌活性的天然化合物，例如肉桂醛，它因其天然来源、高效抗菌性能和良好的生物相容性而受到关注。然而，肉桂醛在实际应用中受到其不稳定性、挥发性和刺激性气味的限制，这限制了其在食品工业中的广泛使用。

为了解决这些问题，研究者们尝试通过将肉桂醛封装在生物可降解的纳米载体中，以提高其稳定性和生物利用度。壳聚糖纳米颗粒因其良好的生物相容性和抗菌性能，成为理想的载药材料。此外，DNase-I作为一种能够降解细胞外DNA（eDNA）的酶，其与壳聚糖纳米颗粒的结合可以增强对生物膜的破坏能力。因此，本研究提出了一种结合肉桂醛和DNase-I的新型纳米结构——DNase-CS-CIN，并评估其在食品接触表面的抗生物膜效果。

### DNase-CS-CIN的制备与特性分析

在本研究中，DNase-CS-CIN是通过壳聚糖与肉桂醛之间的Schiff反应，将肉桂醛封装在壳聚糖纳米颗粒中，随后通过共价偶联的方式将DNase-I引入纳米颗粒表面。这种设计使得DNase-CS-CIN不仅具备壳聚糖纳米颗粒的物理特性，还具有DNase-I的酶活性。通过粒径分析、Zeta电位测定和透射电子显微镜（TEM）观察，发现DNase-CS-CIN具有近似球形的形态，平均粒径为417.29 ± 38.97纳米，具有良好的分散性和稳定性。此外，其封装效率为30.40 ± 3.08%，DNase-I偶联率为59.71 ± 5.27%。这些特性表明，DNase-CS-CIN在结构上是稳定的，并且能够有效负载肉桂醛和DNase-I。

### 抗生物膜活性的评估

通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，发现DNase-CS-CIN能够显著破坏李斯特氏菌生物膜的三维结构，并导致生物膜中细胞外DNA的降解。这表明，DNase-CS-CIN能够有效削弱生物膜的形成机制，从而增强其抗菌效果。此外，实验还发现，DNase-CS-CIN能够显著抑制李斯特氏菌的运动能力，并降低其与生物膜形成和致病性相关的基因表达水平，如*agrA*、*agrB*、*agrC*（群体感应相关基因）、*inlA*、*inlB*（致病性相关基因）和*flaA*、*flaG*（运动相关基因）。这些基因的表达水平降低，进一步支持了DNase-CS-CIN对生物膜形成和维持的抑制作用。

### 在模拟食品加工环境中的表现

为了评估DNase-CS-CIN在真实食品加工环境中的抗生物膜能力，研究者们在模拟的食品模拟液（如鲑鱼汁和猪里脊肉汁）中测试了其对单菌种和混合菌种生物膜的消除效果。实验结果表明，DNase-CS-CIN在25°C和12°C条件下均能有效消除李斯特氏菌和荧光假单胞菌（*P. fluorescens*）的混合生物膜，其对单菌种生物膜的消除效果在不同温度下也表现出显著差异。特别是在25°C时，DNase-CS-CIN对单菌种生物膜的消除效果最为显著，显示出其在高温环境下的高效性。然而，在4°C的低温环境下，其抗生物膜效果相对较低，这可能与DNase-I在低温下的活性下降有关。

此外，DNase-CS-CIN在不同食品模拟液中的表现也显示其具有良好的适应性。例如，在鲑鱼汁中，DNase-CS-CIN在25°C时对李斯特氏菌生物膜的消除效果达到2.21 log CFU/cm2，而在猪里脊肉汁中则为1.53 log CFU/cm2。这些结果表明，DNase-CS-CIN不仅在常温条件下表现出色，而且在食品模拟液中也能够有效抑制和消除生物膜，这为其实用性提供了重要支持。

### 抗生物膜机制的探讨

从分子机制来看，DNase-CS-CIN的抗生物膜效果可能与其对生物膜结构的破坏和对细菌运动能力的抑制密切相关。首先，DNase-I的引入能够有效降解生物膜中的细胞外DNA，从而削弱生物膜的稳定性。其次，肉桂醛的释放能够干扰细菌的群体感应系统，降低其形成和维持生物膜的能力。此外，对细菌运动相关基因的抑制表明，DNase-CS-CIN能够通过干扰细菌的运动能力，从而减少其在食品接触表面的附着和生物膜的形成。

研究还发现，DNase-CS-CIN对混合生物膜的消除效果不如其对单菌种生物膜的效果显著。这可能是因为在混合生物膜中，某些菌种（如*P. fluorescens*）能够分泌更多的细胞外多糖（EPS），从而形成更复杂的生物膜结构，对李斯特氏菌起到保护作用。然而，即使在混合生物膜中，DNase-CS-CIN仍表现出优于其他纳米材料的抗生物膜能力，这可能与其对eDNA的高效降解有关。

### 结论与应用前景

本研究结果表明，DNase-CS-CIN作为一种新型的抗生物膜剂，具有广阔的应用前景。其不仅能够有效抑制和消除李斯特氏菌的生物膜形成，还能在模拟食品加工环境中展现出良好的抗生物膜能力。这种纳米材料的设计思路为开发新型抗生物膜策略提供了新的方向，尤其适用于食品加工行业中的生物膜控制。此外，DNase-CS-CIN的制备方法和性能评估也为后续的生物膜研究提供了参考。

未来，研究者可以进一步探索DNase-CS-CIN在不同食品加工条件下的应用效果，如不同pH值、湿度和营养成分的影响。此外，DNase-CS-CIN的制备工艺也可以进行优化，以提高其负载效率和稳定性，从而扩大其在实际应用中的范围。与此同时，研究还可以关注其对其他病原菌生物膜的抑制效果，以评估其在食品安全领域的广泛适用性。总之，DNase-CS-CIN为食品加工环境中的生物膜控制提供了一种高效、安全且可持续的解决方案，具有重要的科研和应用价值。