用于Visium空间转录组学的矿化组织处理实用方案

《Mechanobiology in Medicine》：A Practical Protocol of Processing Mineralized Tissue for Visium Spatial Transcriptomics

优化骨组织空间转录组学分析的流程，采用Morse溶液替代传统EDTA脱钙，缩短时间至24小时内并保持RNA完整性（DV200值达标），使用SCHOTT NEXTERION? Slide H增强样本附着力，避免形态破坏。实验显示Visium V2平均捕获5639个基因/斑点，Visium HD达170基因/8μm bins（等效4100基因/55μm斑点），显著提升数据质量。

　　在生物医学研究中，随着技术的不断进步，研究人员对组织样本的分析方式也在持续改进。特别是近年来，空间转录组学（Spatial Transcriptomics）作为一种新兴技术，为理解组织内细胞的空间分布和基因表达模式提供了前所未有的视角。空间转录组学通过在组织切片上保留空间信息，使得科学家能够在细胞水平上研究基因表达与组织结构之间的关系，这对于揭示疾病机制、组织再生以及细胞间相互作用具有重要意义。然而，这一技术在处理矿化组织（如骨骼）时仍面临诸多挑战，主要体现在组织脱钙过程中对RNA完整性的破坏以及随后的基因检测效率低下。本文介绍了一种优化的工作流程，旨在提高矿化组织样本在空间转录组学分析中的数据质量，同时确保实验过程的稳定性和可重复性。

### 空间转录组学技术的背景与重要性

单细胞RNA测序（scRNA-seq）在过去的十年中彻底改变了骨骼和肌肉系统的研究方式。通过这种技术，研究人员能够识别出不同骨骼部位在健康和疾病状态下细胞的异质性，发现新的干细胞和前体细胞亚群，并预测其分化轨迹。此外，它还揭示了细胞间交流的新机制，从而加深了我们对组织功能和病理过程的理解。然而，scRNA-seq的一个主要局限在于它无法保留组织内的空间信息，这使得细胞与其微环境之间的关系难以准确解析。因此，空间转录组学的出现为这一领域提供了重要的补充。

空间转录组学技术可以分为两大类：基于成像的方法（如Xenium、MERFISH、seqFISH/seqFISH+）和基于测序的方法（如Visium、Stereo-seq）。前者通过荧光探针杂交和原位成像实现单分子分辨率，适用于已知标记物的假设驱动研究；而后者则通过在组织切片上使用空间编码的RNA捕获技术，结合高通量测序实现无偏的广域或全转录组分析，更适合探索性研究。在矿化组织（如骨骼）的分析中，基于测序的方法，尤其是10x Genomics的Visium平台，因其能够提供高分辨率的空间信息而受到广泛关注。

### 矿化组织处理中的挑战

处理矿化组织时，脱钙是不可或缺的步骤，因为钙质的存在会干扰后续的RNA提取和测序过程。然而，传统的脱钙方法，如使用乙二胺四乙酸（EDTA），通常需要较长的时间，这会显著降低RNA的完整性，从而影响基因检测的效率。此外，脱钙过程可能会破坏细胞的形态结构，导致组织切片在后续处理中发生脱落，进一步降低数据质量。为了克服这些挑战，研究人员探索了更高效的脱钙方案，例如采用Morse溶液进行快速脱钙，同时确保RNA的完整性。这种方法不仅缩短了脱钙时间，还提高了组织切片在后续处理中的稳定性，为空间转录组学分析奠定了良好的基础。

### 优化的脱钙与处理流程

本文提出了一种优化的处理流程，用于骨组织和骨折痂的样本处理，以适应10x Genomics的Visium空间转录组学平台。该流程的关键创新在于将传统EDTA脱钙方法替换为Morse溶液，这是一种由22.5%甲酸和10%柠檬酸组成的混合液，能够在短时间内完成脱钙，同时保持RNA的完整性。实验结果显示，采用这种优化方法后，Visium V2平台在每个斑点中平均检测到5639个基因，而Visium HD平台在每个8 μm的单元格中平均检测到170个基因，相当于每个55 μm的斑点检测到约4100个基因。这一显著提升表明，优化后的脱钙方法有效改善了矿化组织的空间转录组学数据质量。

此外，为了提高组织切片在处理过程中的附着性，实验中采用了SCHOTT NEXTERION? Slide H（3-D水凝胶涂层）这一特殊类型的载玻片。这种载玻片能够有效防止切片在处理过程中脱落，从而保持组织的形态完整性。这一技术的应用不仅提高了实验的可靠性，还确保了后续的空间信息分析能够更加精确。

### 样本处理的详细步骤

为了确保样本处理的顺利进行，研究人员首先对动物进行适当的处理。实验中使用的是12周龄的C57BL/6J雄性小鼠，并在骨折模型中诱导闭合性横断骨折。处理过程中，小鼠被单独处死，随后迅速取出骨骼样本，尽量保留其周围的肌肉组织，以减少对骨组织的破坏。在固定阶段，样本被迅速浸入4%多聚甲醛（PFA）溶液中，以防止内源性RNase对RNA的降解。固定时间根据小鼠年龄和组织大小进行调整，以确保最佳的RNA保存效果。

接下来，样本被浸泡在Morse溶液中进行脱钙。脱钙过程在室温下进行，持续时间为20小时，最长不超过24小时。为了加速脱钙，可在脱钙过程中更换一次新鲜的Morse溶液。脱钙完成的判断可以通过使用27号细针插入骨组织的皮质层来确认，若无明显阻力则表示脱钙成功。此外，也可以通过观察组织的物理状态或使用X射线成像来评估脱钙效果。

脱钙完成后，样本需经过一系列脱水和包埋步骤。脱水过程中，样本依次浸泡在不同浓度的乙醇溶液中（70%、80%、90%、95%、100%），每个步骤持续1小时。随后，样本在室温下进行两次二甲苯处理，再在60–65 °C下进行两次石蜡包埋。这一过程要求样本完全浸没在试剂中，避免因堆积过紧而影响试剂渗透。为了进一步提高样本的处理效率，可以使用低速轨道振荡器辅助试剂交换。

在进行组织切片时，研究人员采用了特定的切片设备和操作方法。首先，将脱钙并包埋的样本放入模具中，确保其切面朝下，并与模具边缘平行。随后，将模具中的样本进行适当调整，以去除气泡并补充石蜡。完成包埋后，样本被放置在-6 °C的冷板上固化，时间根据组织厚度进行调整。固化完成后，使用微切片机进行切片操作，切片厚度控制在5–6 μm。为了确保切片质量，实验人员建议在接近目标解剖平面时，预先收集10–20张切片用于RNA质量评估。此外，为了提高空间转录组学平台的使用效率，可以将两块准备好的样本合并包埋，以最大化测序区域的覆盖范围。

切片完成后，样本需进行适当的处理和固定。为了防止切片在后续处理中脱落，研究人员建议将切片迅速转移至水浴中，并在45 ± 1 °C的载玻片加热器上进行3小时的固化。固化后的切片需放置在低温保存盒中，以保持干燥。随后，切片被直接放置在SCHOTT NEXTERION? Slide H载玻片上，并进行H&E染色以记录组织形态。染色完成后，切片需进行脱蜡、固定、覆盖玻片、成像、去除覆盖玻片、脱色和解交联处理。这一系列操作需按照Visium的标准流程进行，以确保数据的准确性和一致性。

### RNA质量评估与优化策略

在进行空间转录组学分析之前，RNA质量的评估至关重要。研究人员采用DV200作为评估指标，该指标通过Agilent TapeStation 4150/4200或Agilent 2100 Bioanalyzer进行测量。具体操作包括将RNA稀释至5–50 ng/μL，加载1–2 μL样本并加入梯度，随后进行运行和分析。DV200值的计算基于200 nt作为下限，确保RNA的完整性足够支持后续的测序分析。

为了进一步提高RNA质量，实验中采用了一系列优化策略。例如，在脱钙过程中，Morse溶液能够保留更多的RNA完整性，尤其是在18S和28S核糖体RNA的区域，这在DV200曲线中表现为额外的峰值。尽管这些峰值可能代表非特异性结合，但它们并未影响测序质量，反而表明RNA的完整性得到了有效保持。此外，使用SCHOTT NEXTERION? Slide H载玻片能够显著减少切片脱落，从而提高组织的形态完整性。这一特性在实验中得到了验证，不仅在研究人员的实践中表现良好，也在10x Genomics对骨组织、皮肤和乳腺组织的有限内部测试中得到了认可。

### 实验结果与数据质量提升

通过上述优化流程，研究人员成功提高了矿化组织样本在空间转录组学分析中的数据质量。在Visium V2平台中，每个斑点平均检测到5639个基因，而在Visium HD平台中，每个8 μm的单元格平均检测到170个基因，相当于每个55 μm的斑点检测到约4100个基因。这一结果远高于传统EDTA脱钙方法所获得的数据，表明优化后的流程显著提升了RNA捕获效率和基因检测的准确性。

此外，研究人员还发现，Visium HD平台在低质量样本中的表现优于Visium V2平台。由于Visium HD使用了靶向连接探针，而不是传统的poly-A捕获方法，它对RNA完整性的依赖程度较低，从而在低质量样本中仍能保持较高的检测率。同时，Visium HD的非靶向率仅为0.70%，远低于Visium V2的4.13%，这表明该平台在减少非特异性信号方面具有优势。

### 实验的伦理与技术意义

本文的研究遵循了中国医科大学动物伦理委员会的相关规定，并获得了批准（批准号：CMU 2022132）。所有实验操作均符合实验室动物护理和饲养指南，确保实验的伦理合规性。此外，该研究的技术创新不仅适用于骨骼组织，还可能对其他矿化组织（如牙齿、软骨）的处理提供参考。

从技术角度来看，本文提出的优化流程为矿化组织的空间转录组学分析提供了新的思路。传统的脱钙方法往往需要较长时间，且容易破坏RNA完整性，而Morse溶液的引入则有效克服了这一问题。同时，SCHOTT NEXTERION? Slide H载玻片的使用进一步提高了组织切片在处理过程中的稳定性，为后续的基因表达分析提供了更可靠的基础。

### 结论与未来展望

综上所述，本文提出了一种优化的处理流程，能够有效提高矿化组织样本在空间转录组学分析中的数据质量。通过采用Morse溶液进行快速脱钙，结合SCHOTT NEXTERION? Slide H载玻片，研究人员成功克服了传统方法中RNA完整性受损和组织切片脱落的问题。这一流程的优化不仅提高了基因捕获效率，还为未来在骨骼、骨折组织及其他矿化组织的研究中提供了可行的技术方案。

未来，随着空间转录组学技术的不断发展，研究人员可以进一步探索其在更广泛组织类型中的应用。此外，针对不同组织的特性，可以开发更加个性化的处理流程，以提高实验的效率和准确性。例如，对于较厚的组织或更复杂的结构，可能需要调整脱钙时间、脱水步骤或切片厚度，以确保最佳的RNA保存和空间信息保留。同时，随着测序技术的进步，研究人员还可以探索更高分辨率的空间转录组学平台，以获取更详细的基因表达信息。

本文的研究成果不仅为骨骼组织的空间转录组学分析提供了重要的参考，也为其他矿化组织的研究奠定了基础。通过不断优化实验流程和技术参数，科学家们有望进一步揭示组织微环境中的基因表达模式，从而推动相关疾病的机制研究和治疗策略的开发。未来，空间转录组学技术将在生物医学研究中发挥更加重要的作用，为理解复杂组织的生物学特性提供强有力的支持。