用于测定土壤中葛根素生物碱的二维液相色谱法

《Microbiology Resource Announcements》：Two-dimensional liquid chromatography method for the determination of gelsemium alkaloids in soil

Gelsemium生物碱的土壤污染检测采用基于QuEChERS的两维液相色谱法，优化溶剂为乙腈-丙酮（1:5）含1%甲酸，验证显示gelsemine和humantenmine线性良好（r2＞0.999），检测限分别为10和20 ng/g，回收率＞90%，方法灵敏度高且成本效益优于传统HPLC和质谱技术。

　　植物毒素在环境中的迁移与转化行为及其相关健康风险，正受到越来越多的关注。这些毒素可以通过多种途径传播，并对生态系统和人类健康造成潜在危害。其中，口服暴露是最常见的摄入方式，例如通过食用受污染的蜂蜜或其他食品产品。已有研究表明，某些植物毒素如吡咯里西啶生物碱（PAs）能够污染茶叶并最终进入食物链。此外，像胡椒酮这样的单萜类化合物，在土壤环境中可能经历吸附、消散和降解等过程，导致其残留物长期存在。值得注意的是，植物毒素还可能在食物链中发生营养级转移，从食草昆虫转移到更高级的生物体内，从而对不同营养级的生物体造成直接或间接的伤害。这种多条传播路径和累积效应显著放大了其生态和健康风险。

在众多植物中，Gelsemium elegans 是一种具有高度毒性的植物，属于萝藦科（Loganiaceae）的 Gelsemium 属。该植物含有多种 Gelsemium 生物碱，包括 gelsemine、koumine 和 humantenmine 等。这些生物碱的一个显著特征是它们具有独特的单萜吲哚骨架结构。其中，gelsemine、koumine 和 humantenmine 等生物碱能够通过竞争性拮抗 GABA 受体机制表现出强烈的神经毒性，这定义了它们独特的毒理学特性。由于其外观与一些传统中药材如 Lonicera japonica 相似，Gelsemium 植物容易被误食，从而导致人类中毒。此外，Gelsemium 可以作为蜜源植物，其生物碱可能通过某些传粉昆虫转移到蜂产品中，已出现因食用含有 Gelsemium 生物碱的有毒蜂蜜而导致中毒的案例。

在体内，Gelsemium 生物碱表现出良好的吸收能力和广泛的分布特性。例如，在给药后5分钟内，gelsemine、koumine 和 humantenmine 就可以在小鼠的各种组织中被检测到，其中脾脏和胰腺中的浓度最高。这些生物碱的良好脂溶性使它们能够穿过血脑屏障，表明其具有较强的迁移潜力。这种分布模式不仅在小鼠模型中得到证实，也在猪和羊等较大动物中观察到。在中国农村地区，Gelsemium 常被用作家畜和家禽饲料的添加剂，以提高动物的生长性能。然而，这种使用方式也可能导致 Gelsemium 生物碱在动物粪便中富集，并通过施肥等农业活动转移到土壤中，从而对环境造成污染。类似的污染途径也存在于抗生素耐药质粒和高浓度铜等饲料添加剂中。在降雨径流和淋溶作用的影响下，这些有害物质可能进一步进入地表水和地下水系统，其在水体中的积累可能引发严重的水污染，进而对人类健康构成潜在威胁。

一旦释放到水环境中，这些毒素可能会在水体中累积到可观的水平，造成水体污染，并通过食物网进行营养级转移，最终对人类健康构成威胁。然而，目前关于 Gelsemium 生物碱通过粪便进入环境的直接证据和系统性研究仍然有限，这表明在环境介质如土壤和水中的迁移、转化、命运以及生态影响方面存在关键的知识空白，亟需进一步研究。

为了分析植物生物碱，研究者们已经开发出多种提取和样品预处理技术。常用的提取方法包括固液萃取、超声波辅助萃取、固相微萃取、回流萃取、加速溶剂萃取、浸泡萃取、索氏萃取、液液萃取、固相萃取（SPE）以及近年来广泛采用的 QuEChERS 方法。这些技术已被成功应用于植物组织和水样等多种基质。例如，薄层微萃取（TFME）用于检测人体唾液中的生物碱，SPE 用于水样分析，而液液萃取和 QuEChERS 方法则被用于土壤中的生物碱测定。Chuang 等人 [26] 对比了 SPE、液液萃取和 QuEChERS 方法在土壤中提取 ricinine 的效果，结果显示 QuEChERS 方法因其简便性、高效率、低成本、广泛适用性、低劳动强度以及环境友好性而具有明显优势。因此，QuEChERS 方法在土壤基质的生物碱分析中展现出特别的优势。

随着提取技术的进步，生物碱的检测分析技术也取得了显著发展。常用的检测方法包括气相色谱-质谱联用（GC–MS）、高效液相色谱-紫外检测（HPLC–UV）、液相色谱-质谱联用（LC–MS）以及近年来出现的二维液相色谱（2D–LC）。GC–MS 适用于挥发性和半挥发性化合物的分析，如脂肪酸酯，其具有良好的分辨率和灵敏度，并且成本相对较低，但不适合热不稳定物质的分析。HPLC–UV 则因其成本效益而常用于常规定量分析，但缺乏结构鉴定能力。LC–MS 虽然在检测非挥发性和热不稳定的生物碱方面表现出高灵敏度和选择性，但其操作成本较高。而多维液相色谱技术则具备极高的峰容量、强耐受性和高度自动化的特点。在这些技术中，2D–LC 特别适用于复杂基质中的痕量分析，因为它采用两个正交的分离维度，显著提高了峰容量和分辨率，同时保留了分析物的选择性。根据分析目标，2D–LC 可以配置为心切（LC–LC）、综合（LC?×?LC）、多心切（mLC–LC）或选择性综合（sLC?×?LC）模式，其中 LC?×?LC 模式能够实现对结构相似成分的全面覆盖。

在草药分析领域，2D–LC 显示出在多目标定量分析方面的巨大潜力和灵活性。例如，Xu 等人开发了一种多维心切 2D–LC 耦合带电雾化检测器（MHC–2DLC/CAD）的方法，用于传统中药中多种人参皂苷的同时定量分析。同样，2D–LC 在生物碱分析中也展现出卓越的前景。已有研究报道，2D–LC 能够有效减少复杂生物基质如血浆和尿液中的基质效应，并增强对痕量生物碱及其代谢产物的分离和定量能力。在高糖样品如蜂蜜中，2D–LC 耦合 SPE 预处理方法可以有效减少糖类干扰，提高分析的可靠性。在 Gelsemium 植物样本中，综合反相液相色谱（RPLC×RPLC）方法表现出优异的分离能力，能够高分辨率地分离结构相关的生物碱。值得注意的是，2D–LC 的优势不仅限于药品分析，在食品安全、环境污染物筛查以及天然产物的多组分分析中也具有广泛的应用前景。例如，一种多心切 LC–LC 耦合二极管阵列检测器（mLC–LC–DAD）的方法已被成功应用于罐装食品中多种双酚污染物的检测。而综合 2D–LC（LC?×?LC）方法则被用于监测废水中的有机微量污染物，包括药物、农药和个人护理产品。然而，关于土壤中生物碱检测的研究仍较为有限，尚未有研究涉及 Gelsemium 生物碱在土壤中的潜在存在。鉴于 Gelsemium 生物碱在高温下容易降解，而土壤作为化学复杂基质，容易产生强烈的基质效应，因此其检测需要高度选择性和稳健的分析方法。基于此，本研究选择了一种 2D–LC–UV 的策略，以平衡准确度、稳定性与实际可行性，同时考虑目标化合物的理化性质以及土壤基质带来的分析挑战。

本研究在已有的蜂蜜分析方法基础上，进一步优化了实验流程，使其适用于土壤样品的分析。最终开发出的 2D–LC 方法能够有效检测土壤中的两种主要有毒生物碱——gelsemine 和 humantenmine。该方法的建立为土壤中 Gelsemium 生物碱的监测提供了重要的技术支持，有助于制定质量控制标准，并对公众健康保护产生积极影响。通过该方法的应用，可以更全面地了解 Gelsemium 生物碱在土壤中的分布情况，从而评估其对生态环境的潜在影响。此外，该方法的高效性和准确性也为相关环境监测工作提供了可靠的工具，有助于实现对植物毒素污染的有效控制和管理。