一种基于DNA酶和载有结核杆菌（TB）的中孔二氧化硅纳米粒子的电化学生物传感器，用于检测血清中的TdT（端脱氧核苷酸转移酶）

《Microbiology Resource Announcements》：An electrochemical biosensor based on DNAzyme and TB-loading mesoporous silica nanoparticles for detection of TdT in serum

该研究构建了一种基于TB负载介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）的电化学生物传感器，通过Mg2?依赖性DNAzyme实现TdT的特异性检测。该传感器具有5-400 U/mL的线性范围和0.369 U/mL的检测限，在血清中成功应用于白血病相关TdT检测，恢复率91.0%-94.7%。

　　

冯敏桥|尹成燕|秦海亮|刘伟|王云奇|鲁思·安特维-巴阿|饶瑶|徐淑霞

成都理工大学生态与环境学院，中国成都610059

摘要

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在白血病患者中表达活跃，并在维持生物体的遗传多样性方面发挥着重要作用。因此，开发简单灵敏的分析方法以准确检测血清中的TdT具有重要意义。本文建立了一种基于甲苯胺蓝（TB）负载的中孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）的电化学生物传感器，用于检测血清中的TdT。首先合成了带有氨基的MSN，随后将其羰基化得到羧基化的MSN（MSN-COOH），并用其负载TB。接着，MSN-COOH与Mg²⁺依赖性DNA酶的底物链S(rA)-NH₂结合形成S(rA)-NH₂/TB/MSN-COOH。在TdT存在的情况下，TdT可以将脱氧腺苷三磷酸（dATP）添加到Enc-5A的3’-OH末端，激活底物链S(rA)-NH₂的切割活性，从而释放出封装在MSN-COOH中的TB。通过测量TB的电化学信号变化，可以确定TdT的浓度。该方法的线性范围为5至400 U/mL，检测限（LOD）为0.369 U/mL（3 σ/K）。由于DNA酶可以在没有模板的情况下被TdT延伸，因此该生物传感器对其他DNA酶（如T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、DreamTaq DNA聚合酶和Klenow片段（exo-）具有优异的选择性。此外，该生物传感器成功应用于血清中TdT的检测，回收率在91.0%至94.7%之间，表明其在早期检测白血病和其他相关疾病方面的潜力。

引言

DNA聚合酶在生物进化过程中起着关键作用，包括DNA复制、损伤修复和基因重组，这些过程对于维持基因组稳定性和推动生物进化至关重要[1]。根据它们的序列同源性和系统发育关系，DNA聚合酶可以分为六个家族（A、B、C、D、X和Y）[2][3][4][5]。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）属于X家族的DNA聚合酶[6]。与传统DNA聚合酶不同，TdT是一种无需模板的DNA聚合酶，它随机将多个脱氧核苷三磷酸（dNTP）添加到DNA的3’-OH末端[7][8][9]。由于其对DNA延伸的随机作用，TdT的过度表达可能导致基因表达异常。因此，正常细胞通常会抑制其表达以维持基因稳定性。然而，研究表明TdT对生物功能有重要影响，其在体内的表达仅发生在原发性淋巴组织中[10]。TdT现已广泛应用于多个领域，包括肿瘤检测和治疗、免疫组化分析、某些白血病的诊断指标以及某些人类癌细胞的生物标志物[11]。此外，大多数白血病患者（包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）和慢性髓系白血病（CML）[12][13][14]的TdT表达均非常活跃[12][13][14]。因此，TdT既是白血病的标志物，也是潜在的治疗靶点[15]。开发一种灵敏的TdT活性检测方法对于白血病的早期诊断和靶向药物筛选具有重要意义。

传统的TdT浓度测定方法主要包括凝胶电泳分离和免疫学检测[16][17][18]，但这些方法耗时较长、重复性差且灵敏度低[13,19]。这些缺点严重限制了其在快速临床检测和复杂样本（如血清）的痕量分析中的应用。近年来，生物传感技术因其高灵敏度、简单性和实时检测能力而成为检测核酸酶及相关生物标志物的重要手段[20]。其中，电化学生物传感器因其低成本、快速响应和易于微型化而受到广泛关注[21]。

由于中孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）的多孔结构，可以将其用作装载大量电化学指示剂TB的容器[22,23]，而Mg²⁺依赖性DNA酶可以作为门控分子将TB封装在羧基化的MSN（MSN-COOH）内部。当TdT存在时，它可以在没有模板的情况下将dNTP添加到不完整酶链的3’-OH末端，激活底物链的切割活性并释放TB。本文开发了一种新型电化学生物传感器，将DNA酶调控的中孔二氧化硅纳米颗粒与TB信号系统有机结合，实现了无标记和无模板的TdT检测。该方法具有优异的检测限和线性范围，同时成本低廉且操作简便。

材料与试剂

溴化鲸蜡基三甲铵（CTAB）、四乙氧基硅烷（TEOS）、(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷（APTES）和甲苯胺蓝（TB）购自Aladdin（上海，中国）。TdT、phi29 DNA聚合酶（Phi29）、T4 DNA聚合酶（T4）、Dream Taq DNA聚合酶（Taq）和Klenow DNA聚合酶（Klenow）购自Thermo Fisher Scientific（上海，中国）。实验中使用的DNA寡核苷酸由上海Sangon生物工程技术有限公司提供

电化学传感器的检测机制

MSN可用作装载大量电化学指示剂的容器，而Mg²⁺依赖性DNA酶可作为门控分子将TB封装在MSN-COOH内部。为了更好地理解其门控功能，需要明确Mg²⁺依赖性DNA酶的结构特征和切割原理：DNA酶通常由三个部分组成：催化结构域和由酶链与底物链之间的沃森-克里克配对形成的两个识别臂。

结论

总之，我们提出了一种基于染料封装MSN的电化学DNA酶传感器，用于检测血清中的TdT。凭借其优异的负载能力，MSN被用作电化学指示剂TB的载体，并通过Mg²⁺依赖性DNA酶的底物链进行封装。只有在TdT存在的情况下，dATP才能通过TdT的特异性链延长作用添加到酶链的3’-OH末端，从而完全激活酶的切割活性。

CRediT作者贡献声明

冯敏桥：撰写 – 审稿与编辑、实验设计、数据管理。尹成燕：撰写 – 审稿与编辑。秦海亮：撰写 – 审稿与编辑。刘伟：方法学设计、数据管理、概念构思。王云奇：撰写 – 初稿撰写。鲁思·安特维-巴阿：撰写 – 审稿与编辑。饶瑶：撰写 – 审稿与编辑。徐淑霞：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金筹措。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢四川省科技计划（2024YFNH0007）的财政支持。