无需离心处理的自动化样品制备平台在抗菌药物LC–MS/MS分析中的应用

《Microbiology Resource Announcements》：Application of a centrifugation-free automated sample preparation platform for LC–MS/MS analysis of antimicrobials

建立并验证了离心-free自动化的LC-MS/MS样本前处理方法，可同步检测磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、酮康唑和泊沙康唑四种抗生素，方法线性范围广（R>0.99），日内/日间精密度1.3%-6.9%，自动化流程效率提升近两倍，适用于临床免疫抑制患者多重感染监测。

　　近年来，随着分析技术的不断发展，液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（LC–MS/MS）在多个领域中发挥着越来越重要的作用。特别是在临床分析中，LC–MS/MS被广泛应用于激素水平检测、维生素定量分析以及治疗药物监测等关键任务。然而，尽管仪器本身已经具备了高度的灵敏度和选择性，样品前处理过程仍然是影响整个分析效率和准确性的主要瓶颈。传统上，样品前处理通常需要结合液处理、摇床、离心机和蒸发器等设备，但在实际操作中，离心机的集成难度较大，往往需要单独操作，这不仅增加了工作流程的复杂性，还可能导致时间浪费和人为误差的增加。

因此，开发一种无需离心机的自动化样品前处理平台，成为了提高实验室工作效率和降低操作成本的重要方向。本研究提出了一种基于新型ProEQuick PPT固相萃取小柱的自动化流程，该流程与DSSP01预处理系统相结合，能够实现对四种抗微生物药物（磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、伏立康唑和泊沙康唑）的高效检测。通过与传统手动操作方法的对比，该自动化流程不仅在检测结果的一致性上表现优异，还显著缩短了处理时间，提高了操作的稳定性与可靠性。

样品前处理是整个分析流程中最关键的环节之一，尤其是在处理复杂生物基质（如血清、血浆和全血）时，这一阶段的效率和准确性直接影响到最终的检测结果。目前，常用的样品前处理方法包括蛋白质沉淀（PPT）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。其中，PPT因其操作简便、成本低廉、适用范围广而被广泛采用。PPT通过使用有机溶剂、酸或重金属盐使蛋白质变性，然后通过离心或过滤分离沉淀物与上清液。然而，尽管PPT在实际操作中具有诸多优势，其在处理高通量样品时仍存在一定的局限性。例如，手动操作的96孔板和移液器在处理大量样品时效率低下，主要受限于离心机的转速和操作过程中对沉淀物与上清液分离的精确控制。

此外，传统的离心机虽然能够实现高效的样品分离，但其设备成本较高，且需要额外的模块（如开关盖、离心管定位标识等）以确保整个操作的自动化。相比之下，基于压力的过滤方法虽然能够减少对离心机的依赖，但在实际应用中仍面临诸多挑战。例如，许多蛋白质过滤板（如Waters公司的SiroccoTM蛋白质沉淀板）在混合过程中需要密封以防止液体飞溅，而在后续的基于压力的过滤过程中，必须移除密封环，这一过程在自动化操作中较为困难。同时，移液器的使用也可能导致沉淀物堵塞移液头，从而影响混合效率。此外，滤膜在接触样品和试剂时容易形成沉淀，这使得样品添加顺序变得至关重要，任何错误的步骤都可能需要重复实验。而沉淀物在滤膜上的累积则进一步增加了滤膜堵塞的风险。此外，所有溶液都保留在上层板孔中，也增加了交叉污染的可能性。同时，整个系统需要外部设备，如正压气体供应或真空系统，这在某些实验室环境中可能并不便利。

为了克服上述问题，本研究引入了一种无需离心机的自动化流程，该流程通过使用ProEQuick PPT小柱，实现了对四种抗微生物药物的高效检测。ProEQuick PPT小柱的设计特点在于其能够有效防止液体飞溅，同时将沉淀物置于滤膜下方，使上清液能够顺畅地通过滤膜，从而避免因添加顺序不当或沉淀物积累导致的滤膜堵塞。此外，该小柱能够将样品处理过程集中于深孔收集板中，显著降低了交叉污染的风险。更重要的是，由于滤膜仅在压缩结束时才接触沉淀物，因此可以实现无需外部气动设备的向下过滤过程，进一步简化了操作流程。

在实际应用中，抗微生物药物的检测对于临床诊断和治疗监测具有重要意义。例如，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的联合使用是治疗尿路和呼吸道感染的标准方案，尤其在HIV阳性患者的肺孢子虫和斯坦诺氏不动杆菌感染中表现出良好的疗效。然而，该药物组合的吸收率较低，可能导致严重的不良反应，如中性粒细胞减少和血小板减少，甚至因代谢产物引起肾毒性。因此，监测血中药物浓度对于避免药物毒性至关重要。伏立康唑作为治疗曲霉菌感染的一线药物，而泊沙康唑则被用于治疗耐药性侵袭性真菌感染，这两种药物在个体间的生物利用度存在显著差异，因此需要通过治疗药物监测来确保有效的血药浓度并维持治疗效果。

近年来，随着器官移植和免疫抑制治疗的普及，以及艾滋病患者的数量不断增加，真菌感染的发病率也显著上升。这使得对免疫功能低下患者的联合细菌和真菌感染的监测需求日益增长。因此，本研究的目标是通过LC–MS/MS方法对四种抗微生物药物进行同步检测，以评估基于ProEQuick PPT小柱的自动化样品前处理系统的性能。目前，血中药物浓度的检测通常采用高效液相色谱（HPLC）和LC–MS等方法，但对这四种抗微生物药物的同步检测却很少有报道。因此，本研究通过验证LC–MS/MS方法，不仅能够提高检测效率，还能够满足临床对高通量样品处理的需求。

在实验过程中，我们采用了一种基于ProEQuick PPT小柱的自动化流程，该流程与DSSP01预处理系统相结合，能够实现对四种抗微生物药物的高效检测。通过与传统手动操作方法的对比分析，我们发现该自动化流程在检测结果的一致性上表现良好，同时显著缩短了处理时间，提高了操作的稳定性。此外，该流程在处理复杂基质时表现出良好的鲁棒性，减少了人为操作的不确定性。通过采用正压模块与24孔板的结合，我们实现了对上清液与沉淀物的高效分离，无需依赖离心机或外部气体供应。

在具体实施过程中，我们对四种抗微生物药物进行了详细的分析，并通过比较自动化与手动处理的结果，验证了该自动化流程的适用性与效率。我们选择了四种常见的抗微生物药物，即磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、伏立康唑和泊沙康唑，这些药物在临床实践中被广泛使用。其中，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的联合使用是治疗尿路和呼吸道感染的标准方案，其在HIV阳性患者的肺孢子虫和斯坦诺氏不动杆菌感染中表现出良好的疗效。然而，该药物组合的吸收率较低，可能导致严重的不良反应，如中性粒细胞减少和血小板减少，甚至因代谢产物引起肾毒性。因此，监测血中药物浓度对于避免药物毒性至关重要。

伏立康唑作为治疗曲霉菌感染的一线药物，而泊沙康唑则被用于治疗耐药性侵袭性真菌感染，这两种药物在个体间的生物利用度存在显著差异，因此需要通过治疗药物监测来确保有效的血药浓度并维持治疗效果。同时，我们还发现，这些药物在不同患者体内的浓度波动较大，这进一步凸显了治疗药物监测的必要性。通过LC–MS/MS方法，我们不仅能够实现对这四种抗微生物药物的同步检测，还能够提高检测的准确性和可靠性，从而为临床提供更加精准的诊断和治疗建议。

在实验设计中，我们采用了多种滤膜材料进行对比实验，包括PTFE-Q（Agilent，针式滤膜）、尼龙、PTFE和聚丙烯（PP）滤膜。通过将工作溶液添加到血清和血浆样品中，生成特定浓度的加标样品，并比较离心法与滤膜法获得的外部标准峰面积，以确定最适合的滤膜材料。最终，我们发现ProEQuick PPT小柱所使用的滤膜材料在性能上表现最佳，能够有效防止液体飞溅，同时确保沉淀物与上清液的分离效率。

此外，我们还对实验过程中可能出现的误差进行了详细的分析。在实验操作中，样品和试剂的添加顺序、滤膜的接触时间以及过滤过程的稳定性等因素都会对最终的检测结果产生影响。因此，为了确保实验的准确性和可靠性，我们对这些因素进行了优化，并通过多次重复实验验证了其可行性。同时，我们还对实验结果的线性范围、日内和日间精密度进行了详细评估，以确保检测方法的适用性。

通过本研究，我们不仅验证了LC–MS/MS方法在检测四种抗微生物药物方面的有效性，还成功开发了一种无需离心机的自动化样品前处理系统。该系统通过结合ProEQuick PPT小柱和DSSP01预处理平台，实现了对复杂生物基质的高效处理，提高了实验室的工作效率。此外，该系统在处理高通量样品时表现出良好的稳定性，减少了人为操作的不确定性，提高了实验的可重复性。通过与传统手动操作方法的对比分析，我们发现该自动化流程在检测结果的一致性上表现良好，同时显著缩短了处理时间，提高了操作的可靠性。

综上所述，本研究提出了一种基于ProEQuick PPT小柱的自动化样品前处理系统，该系统能够有效提高LC–MS/MS方法在检测四种抗微生物药物方面的效率和准确性。通过与传统手动操作方法的对比，我们发现该自动化流程在处理时间、操作稳定性以及检测结果一致性方面均表现出显著优势。此外，该系统在处理复杂基质时表现出良好的鲁棒性，减少了人为操作的不确定性，提高了实验的可重复性。因此，该自动化流程具有广阔的应用前景，特别是在临床实验室中，能够为治疗药物监测提供更加高效和可靠的解决方案。