由于COX4I1基因的深度内含子变异及新生突变导致的复合体IV缺乏症，会引发进行性的运动功能障碍，并最终发展为Leigh综合征

《Mitochondrion》：Complex IV deficiency due to COX4I1 deep intronic and de novo variants results in progressive motor impairment and Leigh syndrome

线粒体呼吸链复合体IV相关疾病研究扩展了第四例COX4I1基因缺陷病例，揭示患者携带de novo无义突变和深内含子突变，导致COX4I1蛋白水平显著降低及复合体IV功能异常，同时发现线粒体核糖体蛋白表达异常。影像学及生化分析显示符合Leigh综合征特征，并首次通过质谱分析鉴定出复合体IV亚基及线粒体核糖体组装相关蛋白的异常。

　　COX4I1基因编码线粒体呼吸链复合体IV的细胞色素c氧化酶亚基4同工型1，其在细胞线粒体功能中扮演着重要角色。目前，关于该基因的致病性变异报道仍然有限，且每个病例表现出的临床表型各异，缺乏足够的功能数据支持其病理机制。本研究描述了第四例与COX4I1缺陷相关的疾病病例，进一步扩展了这一罕见线粒体疾病的表现特征和遗传多样性，同时提供了新的临床、分子和功能数据。

患者是一名10岁的西班牙男孩，自两岁起便表现出进行性运动障碍。他的父母均为非近亲结婚的健康个体，且有两名健康兄弟姐妹。患者在出生时曾接受主动脉缩窄手术，未出现明显并发症。在最初的几年里，他的心理和运动发育正常，能够独立行走。然而，到了两岁时，他的父母注意到他有右脚步态异常和运动协调能力逐渐下降。他难以上下楼梯和跳跃。四岁时，他被转介给神经儿科医生进行评估。随后几年，他的运动技能进一步恶化，下肢肌张力增加，尽管接受了肉毒杆菌毒素治疗，但并未有效缓解症状。他虽然还能行走，但需要辅助工具来维持长时间的移动。他还表现出痉挛性-肌张力障碍性四肢瘫痪，主要影响右肢，并伴有精细运动技能障碍。此外，他还出现了口腔面部的不自主运动，包括眨眼和运动障碍，这些症状与语言表达、舌头运动和吞咽功能障碍相关。最初，他的认知能力未见明显退化，能够学习和理解指令，并融入社会环境。然而，随着病情进展，他的运动和认知功能均受到影响，导致他需要轮椅进行移动。他的语言能力也下降，因此使用了眼动追踪系统来辅助交流，效果良好。脑部MRI检查显示双侧尾状核和豆状核在T2加权序列中出现高信号，未见脊髓异常，尽管心理运动功能持续恶化，但MRI随访未发现明显变化，这些表现与 Leigh 综合征相符。视觉和体感诱发电位正常，眼科和心血管检查未发现异常。然而，脑电图显示弥漫性慢速觉醒背景脑活动，无癫痫样异常。

生物化学研究表明，患者血浆乳酸水平升高，而丙酮酸水平正常，并且中链和长链酰基肉碱种类水平持续增加。血浆中的丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸水平也升高，但这些测量仅进行了一次。这些生化特征提示可能存在线粒体疾病或多种酰基辅酶A脱氢酶（MAD）缺乏症。然而，通过排除ETFA、ETFB、ETFDH、SLC52A1、SLC52A2和SLC52A3基因突变，并且未对核黄素治疗产生反应，最终排除了MAD缺乏症的可能。肌肉组织的线粒体呼吸链分析显示复合体IV活性显著降低，同时伴有丙酮酸羧化酶活性升高，进一步支持了线粒体疾病的诊断。

基因研究结合了短读和长读下一代测序技术，发现该患者具有独特的基因组合，携带了一个新发的COX4I1无义突变（c.64C>T，p.Arg22Ter）和一个继承的深内含子变异（c.73+1511A>G，p.Glu25ValfsTer9）。功能性研究在患者的组织和瞬时转染的细胞系中进行，显示这些变异主要通过影响COX4I1蛋白水平，进而损害复合体IV的正常组装和活性。蛋白质组学数据进一步表明，该疾病的潜在机制不仅涉及复合体IV功能的调节，还涉及线粒体核糖体蛋白水平的变化。

在对患者基因型的研究中，通过全外显子组测序，发现患者在COX4I1基因中存在一个异质性无义突变。该突变在基因组数据库中的频率极低，且未在父母中发现，表明为新发突变。由于COX4I1突变通常与常染色体隐性遗传疾病相关，因此进一步对患者的成纤维细胞进行了cDNA研究。RT-PCR和琼脂糖凝胶分析显示，患者的成纤维细胞中存在一个较重的分子量迁移带，而对照个体中未见此现象。这表明患者存在异常的mRNA剪接现象。为了明确这一变异的性质，将PCR产物克隆并转化至大肠杆菌中，通过菌落PCR和Sanger测序发现存在三种不同的COX4I1 cDNA群体：一种是野生型COX4I1转录本，另一种是携带新发突变的转录本，第三种则是保留了内含子序列并伴有外显子3前两个核苷酸缺失的转录本。进一步的基因组分析确认了c.73+1511A>G变异是由父亲遗传而来，且两个健康的兄弟也携带该变异，但未携带新发突变。

长读测序技术的应用确认了这两种变异位于不同的等位基因上，即处于转位状态。这一发现对于明确该疾病的遗传模式至关重要。长读测序不仅有助于识别结构变异和重复扩展，还能够对新发变异进行分相分析。在该患者的组织中，两种变异的比例接近50%，表明新发变异可能在胚胎早期发育阶段或母亲的配子形成过程中发生。这一可能性值得进一步研究，因为新发突变通常起源于父亲的配子形成过程。值得注意的是，之前报道的一个COX4I1患者也存在新发变异，但其临床表现相对轻微。此外，COX4I1位于第16号染色体，该染色体含有易发生重组的段落，可能增加新发变异的发生率。因此，这一区域可能更易受到新发变异的影响，但尚需更多研究来验证这一假设。

在功能性研究中，我们发现携带c.73+1511A>G变异的COX4I1转录本在HAP1细胞中表现出异常的剪接模式，导致内含子序列的保留。这与患者成纤维细胞中的观察结果一致，进一步确认了该变异对mRNA剪接的影响。同时，COX4I1蛋白水平在患者的成纤维细胞和肌肉组织中均显著降低，但并未完全缺失。其他复合体IV的亚基在患者的组织中也表现出低稳态水平，且复合体IV的完全组装也受到明显影响。肌肉组织中复合体IV的组装缺陷尤为明显，尽管仍能检测到该复合体的存在，但其活性极低。相比之下，成纤维细胞中COX4I1蛋白水平相对较高，可能足以维持一定量的正常复合体IV组装。

线粒体复合体IV的调控涉及多种机制，包括不同组织中亚基同工型的差异表达以及对特定环境刺激的反应。在正常氧气条件下，COX4I1是主要的同工型，而COX4I2则在肺组织中表达较多，并在缺氧或其他应激状态下更活跃。此前研究提出，COX4I2可能在COX4I1缺陷时部分补偿其功能，如在COX4I1患者成纤维细胞中发现其表达上调。然而，在本研究中，COX4I2的mRNA水平无法通过定量PCR可靠检测，表明这种补偿机制可能不如之前报道的个体明显。患者临床表现的严重程度也高于之前报道的病例，这可能与残余的COX4I1蛋白水平较低有关。

目前，关于COX4I1缺陷的病理机制的研究仍然有限，大多数研究集中在基因敲除细胞模型上。本研究首次在COX4I1缺陷患者中进行了蛋白质组学分析，结果显示不仅复合体IV的结构亚基水平显著降低，还发现线粒体核糖体蛋白的水平也显著下降。这表明，COX4I1缺陷可能涉及复合体IV和线粒体核糖体功能的双重机制。虽然具体分子机制尚未完全阐明，但初步研究表明，至少部分线粒体核糖体组装因子的水平异常可能与该疾病有关。

综上所述，本研究首次报道了第四例与COX4I1缺陷相关的疾病病例，提供了关于该疾病的功能性数据，表明这些变异主要通过降低COX4I1蛋白水平，进而影响复合体IV的活性。此外，蛋白质组学分析还揭示了线粒体核糖体功能障碍的潜在机制。尽管这些发现有助于阐明COX4I1缺陷的主要临床和生化特征，但还需要更多的病例描述和研究来全面定义该疾病的表型谱和潜在的分子机制。