基于酸碱反应的碱性氨基酸赖氨酸/精氨酸的比色-荧光检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Colorimetric-fluorometric detection of basic amino acids lysine/arginine driven by acid-base reaction

该研究合成了一种基于terphenyl结构的双模式探针HTPC，通过酸碱反应实现赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的检测与区分，在药物分析和活细胞成像中展现高灵敏度和选择性。

　　

李一丹|崔明宇|赵玉杰|韩波|李冉|张宇琦|王继江

中国陕西省延安市延安大学石油工程与环境工程学院，邮编716000

摘要

我们合成了一种新型比色-荧光探针3-羟基-[1,1′:4′,1″-联三苯]-4-甲醛（HTPC），用于检测碱性氨基酸赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）。HTPC的响应基于其与Lys/Arg之间的酸碱反应。加入Lys/Arg后，HTPC的丙酮-H₂O溶液在约400 nm处产生新的电子吸收峰，并在约500 nm处发出荧光，吸光度和荧光强度均显著增强。同时，溶液的颜色从无色变为淡黄色，并在紫外光照射下发出蓝绿色荧光。这是因为Lys/Arg利用其末端氨基使HTPC中的酚羟基发生去质子化，从而改变了HTPC的电子云分布，使得荧光团能够独立存在，进而增强了吸光度和荧光强度。此外，通过用Hg²⁺处理探针-氨基酸溶液并监测其荧光特性，可以区分Lys和Arg。比色检测的检出限分别为8.50 μM和2.77 μM，荧光检测的检出限分别为1.92 μM和2.35 μM。该探针被用于准确量化药物中的Lys/Arg含量，并实现了Lys/Arg的活细胞荧光成像。基于酸碱反应的这种比色-荧光探针为构建灵敏的氨基酸检测探针提供了新策略。

引言

氨基酸是蛋白质的基本组成成分，在人体健康和正常功能中起着至关重要的作用，如蛋白质合成、生理调节、免疫力提升以及维持正常的代谢和酸碱平衡[[1], [2], [3], [4], [5]]。例如，赖氨酸（Lys）作为人体必需氨基酸之一，促进钙的吸收和胶原蛋白的形成，并影响肌肉生长和骨骼健康[[6], [7], [8]]。精氨酸（Arg）通过尿素形成参与氮代谢，增强精子活力，并在肝性脑病、性功能障碍和心绞痛的治疗中表现出临床效果[[9], [10], [11], [12], [13]]。因此，Lys和Arg的检测受到了广泛关注。目前有多种方法可以检测Lys和Arg，包括薄层色谱法[14]、毛细管区电泳[15,16]、气相色谱[17,18]、高效液相色谱[19,20]、比色法[[21], [22], [23], [24], [25]]和荧光法[[25], [26], [27], [28], [29], [30]]。其中，比色法是一种直观、可靠且经济的分析方法，可以通过肉眼观察[[21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]]。荧光法具有高灵敏度、宽检测范围、快速分析能力和对多种目标的高度选择性[[25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34]]。例如，基于小有机探针的比色和荧光化学传感器已被开发用于金属离子的检测及其生物成像应用[25,[28], [29], [30]]。在氨基酸检测方面，陈等人开发了一种基于聚二乙炔的比色-荧光探针，借助Mg²⁺来检测Arg/Lys[27]；卢的研究团队报道了一种双比率荧光探针，其中手性碳点（CDs）发出蓝光，卟啉发出红光，用于特异性检测Arg[34]。

尽管比色和荧光方法具有许多优点，但当探针分子不稳定或易受外部条件干扰时，检测效率会受到影响。这些局限性凸显了开发具有更高稳定性和环境抗性的新型探针的迫切需求。因此，开发对环境稳定且不敏感的有机探针成为研究重点。联三苯在热稳定性和化学稳定性方面表现优异，对酸、碱和氧化剂不敏感，是一种有前景的有机探针发色团[[35], [36], [37]]。基于联三苯的荧光探针已被开发用于检测亚精胺[38]和CH₃COO^?及F^?离子[39]。我们的团队报道了一种

联三苯苯并噻唑衍生物，能够灵敏地检测Lys和Arg，但这种联三苯探针无法区分Lys和Arg[40]。因此，设计一种稳定性好、能够同时检测和区分Lys和Arg的新联三苯衍生物探针是很有必要的。

在本研究中，我们合成了一种新型联三苯衍生物3-羟基-[1,1′:4′,1″-联三苯]-4-甲醛（简称HTPC），作为比色-荧光探针用于检测和区分Lys和Arg。响应过程中溶液颜色和荧光强度的变化可以用肉眼观察到。其特征峰强度取决于分析物的浓度，从而实现了Lys/Arg的定量检测。该探针成功应用于药物制剂中Lys/Arg含量的测定，并实现了活细胞中的荧光成像。

材料与表征

4-溴联苯、2-羟基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯甲醛和四(三苯膦)钯由Bide Pharmatech Co., LTD提供。磷酸钾盐和1,4-二氧环烷购自北京InnoChem Science & Technology Co., LTD。所有氨基酸（AAs）均从上海Aladdin Biochemical Technology Co., LTD获得。L-精氨酸瓜氨酸胶囊和赖氨酸肌醇维生素B₁₂口服液由山东杰晶生物技术有限公司提供

HTPC的检测选择性

图1显示了在室温下加入不同浓度（500 μM）的氨基酸并反应1小时后，50 μM HTPC溶液的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。紫外-可见吸收光谱（图1a）显示，加入Lys和Arg后，溶液在约400 nm处出现强而清晰的吸收峰；而其他溶液则没有显示出特征吸收峰。同时，溶液的颜色也发生了明显变化

结论

我们合成了一种比色-荧光探针HTPC，通过酸碱反应实现对碱性氨基酸Lys和Arg的高选择性检测，这两种氨基酸可以通过Hg²⁺进行区分。加入Lys/Arg后，HTPC在约400 nm处的吸光度和在约500 nm处的荧光强度显著增强。溶液在365 nm紫外光照射下从无色变为淡黄色，并发出蓝绿色荧光。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（资助编号：21663032和22061041）以及陕西省科研与共享平台建设项目（资助编号：2021PT-004）的支持。