经过截短处理并功能化的多孔硅生物传感器，用于低成本且早期检测心肌梗死中的肌钙蛋白T

《Talanta》：Truncated PNA-functionalized porous silicon biosensor for low-cost and early detection of troponin T in myocardial infarction

心肌梗死早期诊断的便携式光学传感器开发。通过计算筛选设计12-mer PNA探针，结合多孔硅表面温和硅氢化修饰技术，构建了具有高灵敏度（检测下限0.03 ng/mL）和稳定性的光学传感器。验证了探针与cTnT的特异性结合，优化了pH 5.5的偶联条件，实现0.02-0.16 ng/mL范围的线性响应。该低成本平台显著优于传统ELISA方法，适用于点-of-care快速检测。

　　这是一项关于开发一种基于多孔硅（PSi）的无标记光学生物传感器的研究，该传感器用于高灵敏度检测人类心脏肌钙蛋白T（cTnT），这是一种用于早期诊断心肌梗死（MI）的关键生物标志物。研究的目标是通过优化探针设计和表面功能化策略，降低成本的同时保持高灵敏度和特异性。以下是对该研究的详细解读。

### 1. 研究背景与意义

心肌梗死是一种全球范围内导致死亡的主要原因之一，也是急诊科就诊的重要诱因之一。快速和准确的诊断对于降低死亡率和防止不可逆的心脏组织损伤至关重要。然而，传统的诊断方法，如ELISA检测cTnT，需要中央实验室、专业人员和较长的响应时间，这在临床实践中可能会导致诊断延误，尤其是在需要快速干预的情况下。因此，开发一种快速、准确且可便携的诊断工具，对于提高急诊科效率和实现非中心化检测具有重要意义。

近年来，点对点（PoC）诊断设备的发展为实现这一目标提供了新的可能性。这些设备可以在患者身边进行检测，从而减轻医院的负担，特别是在处理假阳性报警时，能够更迅速地提供结果。然而，目前PoC测试在心肌梗死诊断中的应用仍然有限，主要是因为其高成本和复杂的生产过程。因此，研究开发一种低成本、高灵敏度的无标记生物传感器成为重要的课题。

cTnT作为一种特异性高、灵敏度强的生物标志物，其血清浓度在健康人中极低（通常<0.01 ng/mL），但在心肌损伤后会迅速上升，严重情况下甚至可以达到>100 ng/mL。这种浓度变化为生物传感器的设计提供了重要的参考依据。研究者希望通过优化探针设计和材料选择，实现对cTnT的高灵敏度检测，同时确保设备的低成本和易用性。

### 2. 探针设计与优化

为了实现这一目标，研究者采用了一种截断策略，从一个40个碱基对的野生型序列出发，通过计算筛选方法确定了具有最佳结合亲和力的12个碱基对的候选序列。这一序列被选为后续生物传感器的探针，并在实验中通过Western blot方法验证了其结合特异性。这种设计策略不仅降低了合成成本，还保持了探针对目标分子的高结合能力。

PNAs（肽核酸酸）作为DNA的合成替代物，因其具有更高的稳定性和抗酶降解能力而受到关注。与传统抗体或DNA探针相比，PNAs在生物传感器平台中表现出更优的性能，尤其是在检测蛋白类生物标志物方面。然而，由于PNAs的合成成本较高，特别是对于较长的序列，这限制了其在低成本诊断设备中的广泛应用。

因此，研究者采用了短序列设计策略，以降低合成成本并提高探针的结合效率。在实验中，合成了一系列不同长度的PNA探针（PNA-1, PNA-2, PNA-3, PNA-4），并评估了它们在不同pH条件下的结合能力。最终，PNA-3被选为最佳候选，其结合亲和力接近于野生型序列，且在pH 5.5条件下实现了高效的生物偶联。

### 3. 多孔硅的表面功能化与稳定化

多孔硅（PSi）因其高表面积、简单的电化学蚀刻工艺和低成本的生产特性，成为无标记光学生物传感器的理想材料。然而，新鲜蚀刻的PSi表面容易发生氧化和降解，影响其在生物传感应用中的稳定性。为了解决这一问题，研究者采用了一种温和的热氢硅化方法，利用10-十一烯酸（UDA）将不稳定的Si–H键转化为更稳定的Si–C键，同时引入羧基（COOH）基团，以实现PNA探针的共价偶联。

在表面功能化过程中，研究者使用了反射光谱法来监测PSi表面的光响应变化，这为后续的生物传感提供了重要的反馈机制。通过这种方法，可以直观地观察到探针与目标分子结合后引起的折射率变化，从而实现对cTnT的无标记检测。

此外，为了确保PSi表面在水性条件下的稳定性，研究者还进行了长时间的PBS溶液浸泡测试。结果表明，经过氢硅化处理的PSi表面在水性环境中保持稳定，这为后续的生物传感应用提供了可靠的材料基础。

### 4. 生物传感器的构建与性能评估

在完成PSi表面的稳定化处理后，研究者将其与PNA-3探针进行共价偶联，使用EDC/NHS化学偶联方法。这一过程在pH 5.5条件下进行，以优化探针的偶联效率。通过这种策略，成功实现了PNA探针在PSi表面的高效固定，同时确保了其在实际检测中的稳定性。

随后，研究者测试了该生物传感器对不同浓度cTnT的响应情况。通过分析反射光谱的变化，研究者观察到随着cTnT浓度的增加，光谱出现了明显的红移，表明探针与目标分子之间存在特异性结合。该生物传感器在0.02–0.16 ng/mL的cTnT浓度范围内表现出可重复的响应，其检测限（LoD）为0.030 ± 2.0 × 10?? ng/mL，这在临床应用中具有重要意义。

为了进一步验证该生物传感器的性能，研究者还通过Western blot方法评估了其结合特异性。结果表明，PNA-3探针能够特异性地结合cTnT，而不会与类似分子（如MIF）发生非特异性结合。这一结果为该生物传感器的临床应用提供了重要的支持。

### 5. 研究成果与意义

该研究成功开发了一种基于多孔硅的无标记生物传感器，能够高灵敏度地检测cTnT，其检测限达到了皮克级（0.03 ng/mL），这在心肌梗死的早期诊断中具有重要价值。与传统的DNA探针或抗体相比，该生物传感器在保持高灵敏度的同时，显著降低了成本，为实现低成本、高效率的点对点诊断提供了新的可能性。

此外，该生物传感器的构建策略为未来开发更复杂的多标志物检测系统奠定了基础。研究者提到，未来计划将该方法扩展到同时检测多种心血管标志物，如PD-L1、BNP、MMP-9和hs-CRP等。这种多标志物检测系统的开发，将进一步提升心血管疾病的诊断能力，为临床提供更全面的信息支持。

### 6. 研究方法与技术

在方法部分，研究者详细描述了PNA探针的合成、纯化和分析过程。PNA探针是通过固相合成策略在微波辅助的肽合成仪上合成的，使用了9-芴甲基甲氧基羰基（Fmoc）保护基。在合成过程中，研究者采用了多种化学试剂和溶剂，包括乙基铝二氯化物（EtAlCl?）、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸（MES）等，以确保探针的纯度和功能性。

为了评估PNA探针的结合能力，研究者采用了分子对接和分子动力学模拟（MDs）技术。这些计算方法不仅帮助研究者筛选出最合适的探针序列，还提供了关于探针与cTnT相互作用的分子机制信息。通过这些计算，研究者能够预测探针的结合位置和结合强度，为实验设计提供了重要的理论依据。

在实验验证部分，研究者使用了Western blot方法来检测PNA探针与cTnT的结合情况。实验结果表明，PNA-3探针能够特异性地结合cTnT，并且在不同浓度下表现出明显的结合信号变化。这一结果进一步验证了PNA探针的结合能力和生物传感器的灵敏度。

此外，研究者还采用了反射光谱和荧光显微镜技术来监测PSi表面的功能化过程。这些技术不仅能够评估探针的偶联效率，还能提供关于PSi表面化学变化的直观数据。通过这些方法，研究者能够确保PSi表面在功能化后仍保持良好的光学性能和稳定性。

### 7. 未来发展方向

该研究不仅在技术层面实现了重要突破，还在临床应用方面提供了新的思路。通过结合短序列PNA探针和低成本PSi材料，研究者开发了一种既高效又经济的生物传感器，为未来的点对点诊断设备提供了可行的方案。

未来的研究方向包括进一步优化生物传感器的性能，提高其在复杂生物样本中的检测能力。此外，研究者还计划开发一种多标志物检测系统，以实现对多种心血管标志物的同时检测。这将有助于提高诊断的全面性和准确性，为临床提供更丰富的信息支持。

在技术层面，研究者还希望探索更先进的表面功能化方法，以进一步提高生物传感器的灵敏度和稳定性。此外，研究者还计划将该技术应用于其他生物标志物的检测，拓展其应用范围。

### 8. 研究意义与应用前景

这项研究的成果具有重要的临床和科研价值。首先，它为开发低成本、高灵敏度的心肌梗死诊断设备提供了新的技术路径。通过使用短序列PNA探针和多孔硅材料，研究者成功实现了对cTnT的高灵敏度检测，其检测限达到了0.03 ng/mL，这在临床实践中具有重要意义。

其次，该研究为生物传感器的设计和优化提供了新的思路。通过结合计算方法和实验验证，研究者能够更有效地筛选和优化探针序列，确保其在实际应用中的稳定性和特异性。这种策略不仅适用于cTnT的检测，还可能被推广到其他生物标志物的检测中。

此外，该研究还为生物传感技术的发展提供了重要的理论支持。通过分子对接和分子动力学模拟，研究者能够深入理解探针与目标分子之间的相互作用机制，为后续的传感器优化提供了科学依据。

综上所述，这项研究通过创新的探针设计和材料选择，成功开发了一种低成本、高灵敏度的无标记生物传感器，为心肌梗死的早期诊断提供了新的解决方案。未来，随着技术的进一步优化和应用的拓展，该生物传感器有望在临床实践中发挥更大的作用，为心血管疾病的诊断和治疗提供更有力的支持。