一种集成的前置放大DNA逻辑门平台，通过级联放大技术实现对前列腺癌miRNAs的催化荧光检测

《Talanta》：An Integrated Pre-Amplified DNA Logic Gate Platform with Cascaded Amplification for Catalytic Fluorogenic Sensing of Prostate Cancer miRNAs

前列腺癌特异性miRNA-141和miR-375的高灵敏协同检测平台开发及性能验证，通过集成预扩增DNA逻辑门与级联信号放大技术，结合滚环扩增、杂交链反应及多组分核酸酶催化切割，实现检测限达2.21 fM和2.66 fM的 ultrasensitive 和 excellent specificity，为精准肿瘤学诊断提供新工具。

　　前列腺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是男性癌症相关死亡的主要原因之一。根据2022年的数据，全球新诊断的病例超过150万，导致约40万死亡。早期检测对于提高患者的生存率至关重要，早期确诊的患者5年生存率可超过90%。然而，许多患者在确诊时已出现远处转移，其5年生存率骤降至约30%。目前，前列腺特异性抗原（PSA）仍然是前列腺癌筛查和诊断的主要生物标志物。但PSA并非特指癌症，它在良性疾病如前列腺炎、尿路感染和良性前列腺增生（BPH）中也会升高，因此PSA检测常出现假阳性结果，导致许多男性不必要的活检。这些侵入性程序不仅增加了医疗成本，还对患者的身体和心理造成显著负担。此外，PSA检测还存在较高的假阴性率，可能使部分前列腺癌患者在筛查中被误判为正常，从而延误诊断和治疗，最终导致病情恶化和临床预后变差。

近年来，研究人员发现微小RNA（miRNA）在前列腺癌的诊断和治疗中具有重要价值。miRNA是一类长度为18-22个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与调控多种基因的表达。特别地，某些miRNA的表达模式与特定癌症类型密切相关，可以在生物液体中检测到，因此成为非侵入性生物标志物的有力候选。研究表明，前列腺癌中普遍存在miRNA表达异常，其中miR-141-3p、miR-375和miR-21在前列腺癌患者的血清中持续高表达，并在肿瘤发生中发挥重要作用。miR-141主要在晚期和转移性前列腺癌中升高，反映肿瘤进展和上皮-间质转化过程，而miR-375则倾向于在局部和激素敏感阶段上调，与雄激素受体信号相关。结合这两种miRNA可提供更广泛的诊断窗口，覆盖多种疾病阶段。例如，Porzycki等人通过受试者工作特征（ROC）分析评估了miRNA在区分前列腺癌患者和非癌症对照样本中的能力，显示出其强大的诊断潜力。其中，miR-375表现出最高的曲线下面积（AUC）值为0.906（95%置信区间：0.797-1.001），其次是miR-21（AUC=0.856，95%置信区间：0.680-1.003）和miR-141-3p（AUC=0.831，95%置信区间：0.657-1.00）。

尽管miRNA在诊断中展现出良好的前景，但传统的miRNA检测方法仍面临诸多挑战。例如，实时定量PCR（RT-qPCR）虽然具有较高的灵敏度，但需要复杂的设备，并且容易受到扩增偏差的影响。数字PCR（dPCR）可以实现绝对定量，但成本高且依赖于特定仪器。电化学生物传感器虽然表现出优异的分析灵敏度，但其性能往往依赖于复杂的纳米材料工程或酶驱动的扩增过程，这增加了操作的复杂性并降低了检测的可重复性。为了克服这些限制，近年来，等温核酸扩增技术逐渐成为一种有前景的替代方案。例如，Li等人开发了一种基于商业HCG试纸的便携式RCA-HCR-CRISPR/Cas12a检测方法，用于视觉检测miRNA-21，其检测限为37 fM，表现出良好的特异性和准确性。Wang等人则引入了一种结合熵驱动DNA网络和链置换扩增的CRISPR/Cas12a辅助双扩增策略（CENTER），实现了miR-141的超灵敏检测（检测限为34 aM；血清中诊断准确率为94%）。这些研究展示了近年来在单靶miRNA检测中结合简便性、灵敏性和特异性的进展。然而，传统的单靶miRNA检测方法仍然面临功能异质性以及疾病通路网络特征带来的挑战，这些因素可能导致检测特异性不足，增加假阳性的风险，从而限制对复杂疾病状态的精确解读。越来越多的证据表明，结合多个miRNA生物标志物可显著提高诊断准确性，相较于单一miRNA的检测具有明显优势。因此，开发能够同时检测多个miRNA靶点的技术变得尤为重要。这种技术的进步对于提高诊断特异性和可靠性，以及更准确地理解复杂疾病中的分子交互机制具有重要意义。

目前，传统的多靶miRNA检测策略仍然面临诸多挑战，包括复杂的多引物设计、交叉反应、引物二聚体形成以及多标记探针的高成本。为了解决这些问题，分子逻辑门技术提供了一种创新的解决方案，通过可编程的分子相互作用实现布尔运算（如AND、OR、NOT）。这些逻辑门能够整合多个输入信号，产生特定的输出结果，从而显著提高诊断特异性并减少由单个生物标志物变异导致的假阳性。例如，Liu等人设计了一种Y型DNA探针，作为AND逻辑门使用，其中miR-21和miR-141作为双输入信号，触发EXO III辅助的目标回收过程，随后通过HCR进行扩增，实现了3 pM的检测限。这项工作展示了DNA逻辑电路在多输入miRNA检测中的潜力。然而，大多数现有的逻辑门设计仍然依赖于基于链置换的信号转换，其中扩散受限的分子相互作用在低miRNA浓度下降低了激活效率。这种动力学限制使激活阈值升高至纳摩尔级别，限制了其在检测生理相关浓度miRNA中的应用。

为了解决这一灵敏度限制问题，我们提出了一种集成了预扩增DNA逻辑门平台和级联扩增技术的催化荧光传感系统，用于前列腺癌相关miRNA的超灵敏和特异性检测（IPL-CAFS-PCmi）。该系统首先通过靶向特异性RCA对目标miRNA（miR-141和miR-375）进行预扩增，生成高浓度的DNA输入信号，供后续的逻辑操作使用。然后，输出链通过HCR进行进一步的信号增强。此外，设计了HCR组装的多组分核酸酶（MNAzymes），在Mg2?依赖性条件下切割荧光探针。通过将逻辑门靶向与双扩增（预逻辑RCA和后逻辑HCR）相结合，IPL-CAFS检测方法实现了对miR-141和miR-375在血清中的同时定量检测。该方法克服了传统基于链置换电路的灵敏度限制，同时实现了可编程的多靶检测能力，为临床相关的miRNA诊断提供了可调节的平台。

该平台在检测miR-141和miR-375时表现出优异的灵敏度和特异性，其检测限分别为2.21 fM和2.66 fM。在区分单碱基错配方面，该系统具有良好的特异性，能够有效识别单个miRNA的变异。在稀释的人类血清中，回收率范围在98.51%到99.16%之间，显示出该系统的强稳健性。通过在室温条件下整合RCA与HCR介导的MNAzyme组装，该设计实现了多级级联扩增，显著提高了检测的灵敏度和特异性。这一方法不仅克服了传统基于链置换电路的灵敏度限制，还为多靶miRNA检测提供了新的思路，有望成为精准医学、临床诊断和即时检测中的重要工具。

在本研究中，我们采用了一种集成预扩增DNA逻辑门平台和级联扩增技术的催化荧光传感方法，用于前列腺癌相关miRNA的检测。该方法结合了RCA、HCR和MNAzyme活性，实现了在室温条件下的协同级联扩增，从而同时定量miR-141和miR-375。整个检测流程包括RCA扩增、HCR信号增强和MNAzyme切割荧光探针，能够在低浓度条件下实现高效的信号转换。该平台的设计不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还降低了对复杂疾病状态的解读难度，为临床实践提供了可靠的检测工具。

为了进一步验证该平台的性能，我们进行了详细的实验研究。实验结果显示，该平台在不同浓度的miRNA样本中均能稳定检测，且在复杂背景干扰下仍保持良好的特异性。此外，该平台在实际样本中的应用也显示出其较高的回收率和准确率，表明其在临床诊断中的潜力。通过优化RCA和HCR的条件，我们实现了更高效的信号扩增，从而提高了检测的灵敏度。同时，通过设计HCR组装的MNAzymes，我们确保了荧光探针在低浓度条件下的有效激活，避免了传统方法中因动力学限制导致的灵敏度下降问题。

该平台的应用不仅限于前列腺癌的诊断，还可扩展至其他癌症类型和疾病的检测。通过调整逻辑门的设计，可以实现对多种miRNA的检测，为多靶生物标志物检测提供了灵活性。此外，该平台的可编程特性使其能够适应不同的检测需求，提高检测的通用性和适应性。因此，该技术不仅在前列腺癌的诊断中具有重要价值，还可能成为其他疾病检测中的有力工具。

在实际应用中，该平台的检测方法具有操作简便、成本低廉、无需复杂设备等优势。这些特点使其在资源有限的地区和基层医疗机构中具有更高的适用性。同时，该平台的检测结果能够为临床医生提供更准确的诊断信息，帮助制定更有效的治疗方案。通过提高检测的灵敏度和特异性，该平台有助于减少误诊和漏诊的风险，提高患者的生存率和生活质量。

此外，该平台的设计理念具有广泛的推广价值。通过将逻辑门与级联扩增技术相结合，该方法不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的特异性。这种设计理念可以应用于其他生物标志物的检测，为多靶检测提供新的思路。同时，该平台的可调节性使其能够适应不同的检测需求，提高检测的灵活性和适用性。

综上所述，该研究开发了一种集成预扩增DNA逻辑门平台和级联扩增技术的催化荧光传感系统，用于前列腺癌相关miRNA的检测。该系统通过整合RCA、HCR和MNAzyme活性，实现了在室温条件下的协同级联扩增，从而同时定量miR-141和miR-375。该平台在检测miRNA时表现出优异的灵敏度和特异性，能够有效识别单个miRNA的变异，并在实际样本中保持良好的回收率和准确率。这些优势使其成为精准医学、临床诊断和即时检测中的重要工具，具有广泛的应用前景。