《Talanta》：A high-throughput method for specific, rapid, precise and efficient detection of protein ubiquitination using ThUBD-coated high-density 96-well plates
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泛素化修饰研究新方法：基于ThUBD融合蛋白的高通量检测平台。该平台通过ThUBD涂层96孔板实现泛素化蛋白的高效捕获与定量分析，较传统TUBE方法灵敏度提升16倍，支持多链型泛素化蛋白的全面检测及PROTAC技术发展。
刘慧|陈焕香|李恒|李彦昌|戴嘉兴|杨本东|文洪涛|王永红|常雷|徐平
国家医学蛋白质组学重点实验室，北京蛋白质组研究中心，国家蛋白质科学中心（北京），北京生命组学研究所，中国科学院蛋白质组学研究与发展及新药研究单元，北京，102206，中国
摘要
蛋白质泛素化在细胞信号传导中起着关键作用，其失调与许多常见和难治性疾病的发病机制密切相关。然而，由于现有工具的亲和力有限和连接偏好存在偏差，高通量检测泛素化仍然具有挑战性。在这里，我们使用了一种无偏倚、高亲和力的串联杂合泛素结合结构域（ThUBD）融合蛋白——该蛋白之前由我们实验室开发——来密集地涂覆96孔板。这种方法建立了一个高通量、灵敏且特异的平台，用于识别和定量泛素化蛋白质，能够无偏倚且高亲和力地捕获所有类型泛素链修饰的蛋白质。与涂有串联泛素结合实体（TUBE）的板相比，我们的ThUBD涂覆平台在捕获复杂蛋白质组样本中的多聚泛素化蛋白质时表现出16倍的更宽线性范围。它促进了泛素化信号的高效检测和精确定量，支持对全局泛素化谱以及目标特异性泛素化状态的研究。此外，它还为蛋白酶体靶向嵌合体（PROTACs）的开发提供了强大的技术支持。
引言
泛素化是真核细胞中一种关键且广泛存在的翻译后修饰（PTM）[[1], [2], [3]]。泛素-蛋白酶体系统（UPS）包括泛素（Ub）、泛素激活酶（E1）、泛素连接酶（E2）、泛素连接酶（E3）、去泛素化酶（DUBs）、泛素结合结构域（UBDs）和26S蛋白酶体，是真核细胞中靶向蛋白质降解和质量控制的核心机制，在维持蛋白质稳态和细胞稳态方面起着关键作用[[4], [5], [6], [7], [8]]。除了蛋白质降解之外，UPS还调控几乎所有细胞过程，包括DNA修复、细胞周期调控和免疫反应。其失调与许多常见和难治性人类疾病（如癌症和神经退行性疾病）的发病机制密切相关[[9], [10], [11], [12]]。因此，深入研究细胞内泛素化信号和蛋白质泛素化修饰状态具有重要的科学意义和临床价值。近年来，针对UPS的药物（如PROTACs）已成为研究热点，为疾病治疗提供了新的策略[[13], [14], [15]]。
目前检测泛素化信号的方法主要包括基于质谱（MS）的分析、基于抗体的免疫学检测以及基于UBD的方法[[16], [17], [18], [19], [20]]。质谱技术能够实现泛素化蛋白质及其修饰位点的高通量识别和定量。然而，这种技术依赖于昂贵的液相色谱-质谱仪器、用于胰蛋白酶消化泛素化肽的高亲和力抗体以及大量的蛋白质组样本。它不仅耗时且技术复杂，也无法满足监测低输入蛋白质组样本中微量或超微量目标蛋白质泛素化状态的需求[21,22]。基于抗体的免疫学方法可以简单、快速且经济高效地监测蛋白质和蛋白质组样本的泛素化状态。然而，它们的应用受到针对高度保守的泛素蛋白本身的低亲和力抗体以及对特定泛素链类型偏好的限制[23]。基于荧光标记的UBDs的传感器可以可视化细胞内泛素化信号，但受到繁琐的标记程序和低通量的限制，阻碍了大规模应用[24]。随着技术的进步，高通量泛素化检测技术取得了显著进展。基于荧光（例如TR-FRET、UiFC）和化学发光（例如AlphaScreen、AlphaLISA）的各种方法已被开发出来[[25], [26], [27]]，商业产品如PROTAC检测板也逐渐成为监测蛋白质泛素化状态的有用工具。然而，这些工具中使用的TUBE对泛素链的亲和力较低，限制了它们从复杂蛋白质组中捕获泛素化蛋白质的能力。此外，它们对不同泛素链的富集和检测存在偏差，可能导致检测结果无法反映真实的细胞内泛素化状态。因此，迫切需要开发出高效且精确的蛋白质泛素化研究工具，这些工具应具备无偏倚的识别能力和对不同泛素链的高亲和力[29,30]。
我们实验室之前开发的ThUBD结合了不同泛素结合结构域的优势。它不仅对多聚泛素化蛋白质表现出高亲和力，而且不对任何类型的泛素链产生偏好，从而能够特异性和灵敏地检测泛素化蛋白质[[31]]。基于此，我们的实验室开发了高度灵敏和快速的检测技术，如TUF-WB和TUF-WB+[[[32], [33], [34]]。本研究旨在利用涂有ThUBD的96孔板，开发一个高通量、高灵敏度、高特异性的检测平台，用于无偏倚、高亲和力地捕获、识别和定量所有类型泛素链修饰的蛋白质。
材料
我们实验室维持了表达ThUBD、GFP、Ub-GFP、Ub2-GFP和Ub4-GFP的重组大肠杆菌菌株。HEK293T细胞也在我们实验室中进行培养。ThUBD-HRP是在实验室内部制备的。GST 4FF琼脂糖纯化树脂购自Sangon Biotech（上海）有限公司（上海，中国）。Ni-NTA琼脂糖纯化树脂购自QIAGEN GmbH（德国希伦）。96孔板（型号#3603、3590、3599）购自Corning Inc.（美国康涅狄格州康宁）。
用于高通量检测泛素化信号和泛素化蛋白质的ThUBD涂覆板
Lifesensors公司开发了使用TUBE的96孔板产品（PROTAC检测板），能够实现蛋白质泛素化信号的高通量检测和样本中目标蛋白质泛素化的批量检测[30]。然而，由于TUBE对不同泛素连接方式的固有偏好及其对泛素链的低亲和力[31]，涂有TUBE的96孔板在捕获多聚泛素化蛋白质时的结合能力可能有限，从而限制了检测灵敏度。
结论
使用我们实验室开发的涂有ThUBD的96孔板，这些板对不同泛素链具有无偏倚的富集和检测能力以及高亲和力，我们系统地筛选了高容量96孔板，优化了涂覆条件、洗涤缓冲液和检测条件。具体来说，在Corning 3603型96孔板上涂覆1.03 μg ± 0.002的ThUBD能够特异性结合大约5 pmol的多聚泛素链。
CRediT作者贡献声明
刘慧：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学、数据管理。陈焕香：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化。李恒：方法学。李彦昌：方法学。戴嘉兴：方法学。杨本东：方法学。文洪涛：方法学。王永红：方法学。常雷：方法学。徐平：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、资金获取、数据管理、验证。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们衷心感谢清华大学饶宇教授在本项目早期阶段的讨论。本研究得到了国家基础研究计划（2024YFC3405400和2022YFA1304600）、北京生命科学研究院（BLSA）（2024300CB0100）、CAMS医学科学创新基金（2019-I2M5-017和2022-I2M-C&T-B-082）、国家自然科学基金（32141003和32371503）、北京科学基金（L246037）以及国家重点实验室基金会的支持。
