快速建立布尼亚病毒假型病毒中和检测系统：应对大流行威胁的新策略

《npj Vaccines》：A system to rapidly develop a bunyavirus pseudotyped virus neutralisation assay for pandemic preparedness

本文推荐一项针对布尼亚病毒假型病毒(PV)快速构建系统的研究。为解决高致病性布尼亚病毒需在高等级生物安全实验室操作的限制，研究人员开发了基于水疱性口炎病毒(VSV)的"即插即用"系统，成功构建了裂谷热病毒(RVFV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、大别班达病毒(DABV)和奥罗普切病毒(OROV)的假型病毒。该系统可在5天内获得可用于血清学检测的PV，其中和试验结果与真病毒中和试验高度相关(r=0.8027)，为布尼亚病毒疫苗和 therapeutics 评价提供了更安全、高效的技术平台。

　　

在当今全球公共卫生领域，新发传染病的威胁日益严峻。世界卫生组织(WHO)已将布尼亚病毒目(Bunyavirales)中的多个病毒家族列为高流行或大流行风险病原体。这些病毒包括裂谷热病毒(RVFV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)等，它们可能引发严重的公共卫生危机。然而，研究这些高致病性病毒面临巨大挑战：必须在高等级生物安全实验室(如BSL-4)中操作真病毒，这不仅成本高昂、耗时，而且限制了研究的广泛开展。

传统的病毒中和试验是评估疫苗免疫反应和治疗性抗体效价的"金标准"方法，但对于布尼亚病毒这类高致病性病原体，使用真病毒进行检测存在显著局限性。假型病毒(Pseudotyped Virus, PV)技术为解决这一难题提供了新思路。PV是通过基因工程改造的病毒载体，其表面展示目标病毒的糖蛋白，但内部基因组缺乏复制能力，因此可以在低防护等级实验室安全使用。

然而，布尼亚病毒假型病毒的构建面临特殊挑战。这类病毒在细胞内膜系统(如高尔基体)中组装和出芽，其糖蛋白(Gn和Gc)主要定位于细胞器内，而大多数病毒载体的出芽和糖蛋白获取发生在细胞膜上。这种定位差异导致布尼亚病毒假型病毒的生产效率低下，需要复杂耗时的优化过程。

在这项发表于《npj Vaccines》的研究中，由Federica Marchesin领衔的国际研究团队开发了一套快速生成布尼亚病毒假型病毒的"即插即用"系统。研究人员选择了两类原型病毒：代表斑蝠病毒科(Phenuiviridae)的裂谷热病毒(RVFV)和代表内罗病毒科(Nairoviridae)的克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)，系统优化了假型病毒生产的关键参数。

研究团队首先比较了两种常用的假型病毒平台：基于水疱性口炎病毒(VSV)的载体和基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体。结果显示，VSV平台在假型病毒产量上具有明显优势，RVFV假型病毒的产量比HIV-1平台高约10倍，且无需超速离心浓缩即可获得足够滴度用于后续实验。

研究人员进一步优化了假型病毒生产的关键参数，包括转染试剂种类、糖蛋白表达质粒用量以及是否使用人源密码子优化序列。他们发现，使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，以6μg质粒转染400万个人胚肾293T/17细胞(HEK293T/17)，可在保证高假型病毒滴度的同时，获得最低的批间差异。虽然密码子优化未显著提高假型病毒滴度，但显示出提高产量的趋势。

为验证该系统的通用性，研究人员将其应用于其他重要的布尼亚病毒：大别班达病毒(DABV，引起严重发热伴血小板减少综合征)和奥罗普切病毒(OROV)。令人印象深刻的是，在获得合成糖蛋白序列后的5天内，研究人员就成功制备出了具有使用滴度的DABV和OROV假型病毒，证明该系统确实具有"即插即用"的快速响应能力。

研究人员还发现，不同布尼亚病毒假型病毒在不同细胞系上的感染效率存在差异。RVFV和DABV假型病毒在Vero细胞和Huh7细胞上的滴度相似，而CCHFV和OROV假型病毒在Huh7细胞上的滴度显著高于Vero细胞。这种差异可能反映了不同病毒家族在受体使用上的不同。

特异性中和实验显示，针对各病毒的特异性抗体只能有效中和相应的同源假型病毒，而对其他布尼亚病毒假型病毒的中和效果不足50%，证明了该系统中假型病毒的特异性和可靠性。

最重要的是，假型病毒中和试验(PVNA)与真病毒中和试验结果高度一致。对CCHFV康复者血浆的检测结果显示，除一个样本外，其余样本的中和活性排名与已发表数据一致。对60份RVFV暴露者血清的检测显示，假型病毒中和试验与微中和试验(MNA)结果呈显著正相关(r=0.8027)，Deming回归分析和Bland-Altman一致性检验进一步证实了两种方法的高度一致性。

主要技术方法包括：使用基于水疱性口炎病毒(VSV)的假型病毒平台，优化糖蛋白(GnGc)表达条件和转染参数；采用荧光素酶报告基因系统进行假型病毒滴度测定；利用假型病毒中和试验(PVNA)评估抗体反应；使用真病毒微中和试验(MNA)进行方法验证。人类样本包括来自肯尼亚的60份RVFV暴露者血清和来自土耳其的7份CCHF康复者血浆。

VSV是布尼亚病毒假型化的更好平台

研究比较了VSV和HIV-1两种假型病毒平台对RVFV和CCHFV假型病毒的生产效率。结果显示，VSV平台产生的RVFV假型病毒滴度比HIV-1平台高约10倍，且HIV-1平台需要超速离心浓缩才能达到可比滴度。CCHFV假型病毒生产也观察到类似结果，表明VSV平台是生产布尼亚病毒假型病毒的更优选择。

RVFV和CCHFV VSV假型病毒生产的共享最优条件

研究系统评估了影响假型病毒产量的关键参数，包括转染试剂种类、糖蛋白表达质粒用量和密码子优化。发现使用PEI转染试剂，以6μg质粒转染HEK293T/17细胞可获得最高且最稳定的假型病毒滴度。虽然密码子优化未显著提高滴度，但显示出提高产量的趋势。免疫印迹证实了糖蛋白在假型病毒颗粒上的成功整合。

优化后的布尼亚病毒假型系统显示不同病毒家族具有不同的细胞系敏感性

应用优化后的条件，研究在5天内成功制备了DABV和OROV假型病毒。不同假型病毒在不同细胞系上的感染效率存在差异：RVFV和DABV假型病毒在Vero和Huh7细胞上滴度相似，而CCHFV和OROV假型病毒在Huh7细胞上滴度显著更高，反映了不同病毒家族在受体使用上的差异。

抗体特异性中和相应的布尼亚病毒假型病毒

特异性中和实验显示，各病毒的特异性单克隆抗体只能有效中和相应的同源假型病毒，而对异源假型病毒的中和效果不足50%，证明了假型病毒系统的特异性和可靠性。

布尼亚病毒假型病毒中和与真病毒中和相当

假型病毒中和试验与真病毒中和试验结果高度一致。CCHFV康复者血浆的检测结果与已发表数据基本一致。RVFV暴露者血清的检测显示，假型病毒中和试验与微中和试验结果呈显著正相关(r=0.8027)，统计分析证实了两种方法的高度一致性。

本研究成功建立了一套快速生成布尼亚病毒假型病毒的"即插即用"系统。该系统基于VSV平台，通过优化关键参数，可在5天内制备出适用于血清学检测的假型病毒。研究证明，基于该系统的中和试验与真病毒中和试验结果高度一致，为布尼亚病毒疫苗和治疗性抗体的评价提供了安全、高效的技术平台。

这一系统的建立对大流行防范具有重要意义。它使研究人员能够在低防护等级实验室安全地研究高致病性布尼亚病毒，大大降低了研究门槛和成本。特别是在应对新发传染病威胁时，该系统可快速应用于未知但相关的布尼亚病毒，支持"100天使命"目标的实现，为全球公共卫生安全提供重要技术支撑。

该系统的一个局限性是只能评估针对病毒糖蛋白的免疫反应，但考虑到糖蛋白是中和抗体的主要靶点，这一限制对大多数应用场景影响有限。未来，随着更多布尼亚病毒序列的解析和该系统的进一步优化，它有望成为布尼亚病毒研究和医疗对策开发的标准工具。