环境与营养调控对枯草芽孢杆菌自发荧光特性的影响研究及其应用前景

《Scientific Reports》：Investigating the influence of diverse treatments on the autofluorescence properties of Bacillus subtilis

本研究针对细菌自发荧光(Bacterial autofluorescence)特性易受环境因素干扰、影响检测准确性的问题，系统探究了不同处理条件对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)自发荧光的影响。研究发现葡萄糖限制显著降低荧光强度，H2O2处理改变荧光谱图，而乙醇处理增强荧光信号。该研究为自发荧光技术在微生物监测、应激响应评估等领域的精准应用提供了重要理论依据。

　　

在微生物研究领域，如何无创、实时地监测细菌的生理状态一直是个重要课题。传统方法如菌落形成单位(CFU)计数不仅耗时耗力，还可能漏检那些存活但不可培养(VBNC)的细菌细胞。正是在这样的背景下，细菌自发荧光技术因其无需外源染色、能够避免对细胞生理造成干扰的独特优势，逐渐展现出巨大的应用潜力。

自发荧光是某些细胞内分子固有的发光现象，主要来源于内源性荧光团(fluorophores)，如黄素(flavins)、NADH和芳香族氨基酸等。这些荧光团可以作为细胞代谢、氧化还原状态和环境应答的动态报告器。通过监测自发荧光强度、光谱特征和亚细胞定位的变化，研究人员能够获得关于细胞生理、应激响应和代谢活性的宝贵信息。然而，自发荧光的广泛应用面临一个关键挑战：其信号易受环境因素和生理变量的影响。例如，营养变化或应激诱导的代谢改变可能改变荧光强度或光谱特征，从而导致对细胞活力或代谢活性的误判。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为自发荧光研究的典范模型，因其遗传可操作性、代谢多功能性以及明确的内源性荧光团而备受青睐。其厚厚的细胞壁确保了信号稳定性，而遗传操作能力使得能够精确研究荧光团。这种细菌在不同生理状态下表现出独特、可重复的自发荧光模式，使得能够无标记监测代谢活性和应激响应。

Mohammad Kazem Momeni等人发表在《Scientific Reports》上的研究，正是为了系统揭示各种处理条件对枯草芽孢杆菌自发荧光特性的影响。研究团队假设生长培养基的营养成分变化或环境应激物的暴露可能会影响这些内源性荧光团的自发荧光特性，这一认识对于优化自发荧光在各种应用中的使用以及理解其在微生物生理学中的作用至关重要。

为开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。他们使用枯草芽孢杆菌菌株PTTC 1254，通过营养限制(碳缺乏、氮缺乏)和环境应激(氧化应激、温度应激、pH应激、乙醇处理)等处理条件，利用光学密度(OD)测量进行数据标准化，通过荧光光谱法(激发波长365 nm和405 nm)分析自发荧光光谱特征，结合荧光显微镜进行可视化验证，并比较了不同裂解方法(高压灭菌、煮沸、超声处理)对荧光特性的影响。

研究结果

枯草芽孢杆菌的自发荧光光谱分析

研究记录了枯草芽孢杆菌在250-900 nm范围内的自发荧光发射光谱。光谱显示在激发波长为365 nm和405 nm时，有两个显著的发射峰：一个在约370 nm处(对应激发波长)，另一个在约750 nm处，表明在近红外区域存在自发荧光。这些发现与可见光成像范围一致，突出了枯草芽孢杆菌自发荧光的光谱特征，这些特征可能因不同的环境或实验条件而变化。

营养变化对荧光发射的影响

在葡萄糖限制条件下，枯草芽孢杆菌的自发荧光强度在365 nm和405 nm激发波长下均显著降低。在405 nm激发下，荧光强度从对照组的17.423降至葡萄糖限制下的4.356，峰值发射在473 nm从102.674降至25.717，在805 nm从360降至90。类似地，在365 nm激发下，总体强度从14.015降至3.504，峰值发射在418/451 nm从105.578降至37.294，在726 nm从546.948降至136.737。这些降低强调了葡萄糖在维持枯草芽孢杆菌自发荧光特性中的关键作用。

环境应激物对荧光发射的影响

研究发现不同的环境应激物对枯草芽孢杆菌自发荧光产生显著影响。过氧化氢(H₂O₂)处理在805 nm处增加荧光强度，但在473 nm处降低强度。乙醇处理显著增强荧光强度，在405 nm激发下，乙醇处理样品在468 nm(209.817)和805 nm(467.820)处显示峰值。冷处理在405 nm激发下显著增强各种波长的荧光强度，热处理改变峰值强度，酸处理在472 nm处增加荧光强度，但在805 nm处降低发射。碱处理增强荧光强度，特别是在473 nm和726 nm处。

自发荧光的显微镜分析

使用ImageJ软件进行的荧光分析表明，在365 nm激发波长下，细菌载玻片表现出明显的绿色发射。当在365 nm和405 nm观察时，样品显示出显著的蓝色和绿色荧光。这些发现证实了枯草芽孢杆菌中存在波长特异性自发荧光，绿色和蓝色发射对应于使用的不同激发波长。

煮沸、高压灭菌和超声处理对自发荧光特性的影响

高压灭菌显著影响枯草芽孢杆菌的自发荧光。上清液显示强度降低，峰值在365 nm激发的445 nm(11.472)和727 nm(25.742)处，以及在405 nm激发的468 nm(7.493)和805 nm(12.829)处。沉淀显示强度增加，峰值在365 nm的726 nm(1015.844)和405 nm的805 nm(530.337)处，超过对照值。典型的450 nm左右的第一峰值在高压灭菌沉淀中完全消失。

煮沸裂解沉淀的吸收光谱显示在760-770 nm(71.974)和405 nm(0.901)处有显著峰值(针对405 nm激发)，以及在726 nm(116.259)和405 nm(1.508)处(针对365 nm激发)。煮沸裂解上清液在387 nm(12.08)和404 nm(26.674)处有峰值(针对365 nm激发)，以及在426 nm(42.043)和440 nm(0.068)处(针对405 nm激发)。

超声处理显著增强了枯草芽孢杆菌的自发荧光，特别是在405 nm激发下。裂解沉淀在435 nm(约1.79)和770 nm(约204.57)处显示峰值，在365 nm激发下在440 nm(约2.17)和470 nm(约1.32)处有较小峰值。上清液在两个激发波长下在440 nm(4.065 AU)处显示突出峰值。

统计分析的显著性

所有自发荧光测量显示统计学显著差异(p<0.05)。葡萄糖限制产生p值0.003(365 nm)和0.002(405 nm)。对于环境应激物：H₂O₂处理显示p=0.001(805 nm增加)和p=0.008(473 nm减少)；乙醇增强高度显著(p<0.0001)。温度效应对于冷(p=0.02-0.04)和热处理(p=0.03-0.05)均显著。酸性和碱性条件产生p值0.04和0.01。裂解方法显示极端显著性：高压灭菌(p<0.0001)和超声处理(p=0.004)。

研究结论与意义

这项研究全面评估了不同处理(包括营养变化和环境应激物)对枯草芽孢杆菌自发荧光特性的影响。研究结果证明自发荧光不是静态特性，而是显著受细胞生理和环境条件影响的动态特征。

营养限制，特别是葡萄糖限制，显著降低自发荧光强度，突出了营养可用性在调节细胞荧光中的关键作用。环境应激物产生不同的影响：虽然酸性和碱性条件有适度影响，但过氧化氢诱导的氧化应激显著改变荧光谱图。相反，乙醇处理通过细胞膜或代谢途径的相互作用增强荧光。热和冷应激对自发荧光影响最小，表明枯草芽孢杆菌在这些条件下的韧性。裂解技术，如高压灭菌和超声处理，显著影响荧光强度和光谱特征，强调了在分析细菌自发荧光时考虑裂解方法的重要性。

这些发现强调了细菌自发荧光对环境线索的敏感性及其作为监测细菌健康、应激响应和代谢活性有价值工具的潜力。该研究为自发荧光技术在微生物诊断、环境监测和生物技术等领域的精准应用提供了重要理论依据，强调了在动态和异质环境条件下解释自发荧光信号时需要考虑营养可用性、环境应激和裂解方法等因素。需要进一步研究以阐明这些观察到的变化背后的具体分子机制，并探索自发荧光技术在微生物学和生物技术应用中充分发挥潜力。