人神经前体细胞分化中钙信号重塑与ORAI3调控作用机制研究

《Scientific Reports》：Remodeling of calcium signaling and store operated calcium entry as a consequence of human neural progenitor cell differentiation

本研究聚焦神经发育关键环节，针对人神经前体细胞分化过程中钙信号通路重塑机制尚不明确的问题，通过高内涵成像与基因编辑技术，系统揭示了分化伴随的钙振荡增强、内质网钙稳态重构及ORAI3介导的非经典钙池操纵性钙内流（SOCE）调控作用，为神经发育疾病靶点发现提供了新视角。

　　

在人脑发育的复杂交响曲中，神经前体细胞分化为神经元和胶质细胞的过程如同精密的乐章，而钙离子（Ca²⁺）信号则是其中不可或缺的指挥棒。钙信号不仅调控神经前体细胞的增殖与存活，更通过调节基因表达直接驱动分化进程。然而，人类神经分化过程中钙信号通路的动态重塑机制，尤其是钙池操纵性钙内流（Store-Operated Calcium Entry, SOCE）这一重要途径的变化规律，仍是一片待探索的领域。SOCE主要由STIM（基质相互作用分子）和ORAI蛋白介导，负责在细胞内质网钙库耗尽后激活细胞膜上的钙通道，以补充钙库并维持钙稳态。尽管SOCE在小鼠神经前体细胞中的作用已有报道，但其在人类神经分化中的角色及调控网络仍是未知数。

为了解决这些问题，来自澳大利亚昆士兰大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新成果。他们利用人神经前体细胞系ReNcell VM，结合基因编码的钙指示剂jRCaMP1b和高内涵活细胞成像技术，首次系统描绘了神经分化过程中钙信号的特征性变化，并深入揭示了SOCE通路关键组分（ORAI1-3, STIM1-2）的表达重塑，特别是发现了ORAI3的上调在分化过程中的潜在关键作用。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用表达jRCaMP1b钙指示剂的ReNcell VM细胞系进行长期活细胞钙成像；通过免疫荧光和qPCR技术鉴定分化细胞类型及标志物表达；使用shRNA基因敲降技术研究ORAI3的功能；通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测ORAI1和STIM1蛋白表达变化。

分化后钙信号活动增强

研究首先证实，去除生长因子可诱导ReNcell VM细胞成功分化为神经元（β3-微管蛋白阳性）和星形胶质细胞（GFAP阳性）。

indicates significance in comparison to 0 day differentiated(n=3 independent experiments,p<0.05).(d) Orthogonal projection of jRCaMP1b fluorescence intensity over 150 s in proliferative(upper) and 7 days differentiated ReNcell VM-jRCaMP1b cells(lower). Dashed line marks the plane section used for generating the orthogonal projection. Images representative of three independent experiments conducted in duplicate wells.(e) Percentage of active and inactive cells, defined as a cell reaching a F/Fmin increase of greater than 1.2 during the observation period. Bars are mean± SD, dots are population average per experiment. Experiments were conducted in duplicate wells across three independent experiments. Results were analysed via two-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's Least Significant Difference test*p<0.05.'>

高内涵钙成像显示，与静息状态的增殖期细胞相比，分化后的细胞自发钙瞬变活动显著增加。通过单细胞分析将钙活动分为四类（静止、短暂、规律、持续），发现分化细胞中“短暂”和“规律”振荡类别的细胞比例和振荡频率均显著高于增殖期细胞，表明分化不仅增强了钙活动，更重塑了其活动模式。

分化细胞对刺激的反应改变

当用ATP（激活嘌呤能受体）或卡巴胆碱（胆碱能激动剂）刺激细胞时，分化细胞表现出更高的峰值胞质钙浓度（[Ca²⁺]_CYT）和更多的钙振荡。然而，当使用肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）抑制剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）或环匹阿尼酸（CPA）耗尽内质网钙库时，增殖期细胞出现持续的[Ca²⁺]_CYT升高（提示存在基础钙泄漏并激活了SOCE），而分化细胞则几乎没有反应，暗示其内质网钙泄漏减少，SOCE激活潜力降低。

SOCE组分表达重塑

对SOCE核心组分mRNA表达的分析揭示了一个显著的模式转变：随着分化，经典通道ORAI1表达先降后升，但其蛋白水平在分化14天后仍显著下调；而非经典通道ORAI2和ORAI3的mRNA表达则持续显著上调。STIM1的mRNA和蛋白水平在分化后期均上调，而STIM2表达无显著变化。这种从ORAI1向ORAI2/ORAI3的转变，提示分化伴随着从经典SOCE向非经典形式的转化。

ORAI3调控分化进程

鉴于ORAI3在分化过程中上调最为显著，研究人员利用shRNA敲降ORAI3表达，发现这导致神经元标志物MAP2和星形胶质细胞标志物GFAP的mRNA表达显著降低，表明ORAI3是ReNcell VM细胞分化的潜在正调控因子。

综上所述，该研究揭示了人神经前体细胞分化伴随着深刻的钙信号重塑：分化细胞表现出增强的自发和刺激诱发的钙振荡，但对内质网钙库耗竭的反应减弱，这与SOCE核心组分从经典的ORAI1主导转向ORAI2/ORAI3表达上调密切相关。尤为重要的是，研究首次将ORAI3鉴定为人类神经分化的一个新型调控因子。这些发现不仅深化了对神经发育过程中钙信号调控机制的理解，而且为基于ReNcell VM细胞模型研究神经发育障碍、神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）和神经炎症提供了新的视角和高效的研究方法。该研究建立的高内涵钙成像平台也为未来针对神经系统疾病的药物筛选和靶点验证奠定了技术基础。